|
Далее считались данные каждой лунки на микропланшетном ридере при длине волны 450 пт, используя как контроль данные лунки, содержащей по 100 рЬ Стабилизированного Хромогена и Завершающего Раствора. На графической бумаге фиксировались данные стандартов и стандартные концентрации; стандартные кривые для ЫЖ5 строились в координатах: оптическая плотность против концентрации. В неизвестных образцах и контролях определение концентраций ЫЖ5 проводились по построенной стандартной (калибровочной) кривой. Рабочим отрезком, была наиболее близкая к линейной часть кривой. Начало калибровочной кривой, при восстановлении перпендикуляра из этой точки на ось абсцисс, соответствовало значению чувствительности данной тест системы, т.е. минимальному количеству вещества, которое можно определить с ее помощью. Образцы, дающие сигнал больший, чем в наибольшем стандарте (для ЫЖ5 5000 р §/тЬ) разбавлялись Стандартным Буферным Растворителем (поставляемый реагент) и вновь подвергались анализу. Используемые в нашем исследовании иммуноферментные тестсистемы, обладали следующими характеристиками: • Точность основывалась на сравнении результатов повторных анализов одного и того же образца в одном опыте (точность внутри исследования — образцы с известной концентрацией были исследованы для БК5 16 раз) и в разных опытах (точность между исследованиями, образцы для 1Ж5 исследовалась 42 раза). • Чувствительность. Минимальное определяемое количество вещества для ОК.5 составляет < 25 р&/тЬ (данные были определены с помощью добавления двух отклонений от значения оптической плотности, полученного, когда нулевой стандарт исследовался-30-кратно). • Линейность разведения. Человеческая сыворотка и субстрат культуры тканей, содержащий 10% фетальной сыворотки теленка были помечены ЫЖ5 и серийно разбавлены Стандартным Буферным Растворителем, 64 |
1 Стрептавидин-НКР Растворителем в соотношении 10:1). Фермент "реагирует” с биоппш-связанными АТ, тем самым, дополняя четырехслойный "сандвич”. Затем вновь инкубировали 30 минут и осуществляли промывку по вышеуказанной методике, для устранения избытка фермента. После третьей инкубации и промывания добавляли раствор субстрата (100 мкл) реагент-Стабилизированный Хромоген, (ТМВ) тетраметнлбензидин {он взаимодействует со связанным ферментом с образованием цвета, причем интенсивность окрашивания прямо пропорциональна концентрации НйК5 и И УЕСТ в данных образцах). Жидкость в лунках начинала менять цвет на синий. Инкубировали в течение 30 минут, при комнатной температуре, в темноте. Затем добавлялся Завершающий Раствор (100 мкл) и цвет с синего менялся на желтый. Далее считались данные каждой лунки на микропланшетном ридере при длине волны 450 пт, используя как контроль данные лунки, содержащей но 100 цЬ Стабилизированного Хромогена и Завершающего Раствора. На графической бумаге фиксировались данные стандартов и стандартные концентрации; стандартные кривые для ШК5 и ЕУЕОР строились в координатах: оптическая плотность против концентрации. В неизвестных образцах и контролях определение концентраций ЮК5 и ЬУЕОР проводились по построенной стандартной (калибровочной) кривой. Рабочим отрезком, была наиболее близкая к линейной часть кривой. Начало калибровочной кривой, при восстановлении перпендикуляра из этой точки на ось абсцисс, соответствовало значению чувствительности дайной тест системы, т.е. минимальному количеству вещества, которое можно определить с се помощью. Образцы, дающие сигнал больший, чем в наибольшем стандарте (для ШК5 5000 р^/тЬ, для ЬУЕОР 1500 р^/тЬ) разбавлялись Стандартным Буферным Растворителем (поставляемый реагент) и вновь подвергались анализу. 10 Стрептавидин-НКР Растворителем в соотношении 10:1). Фермент "реагирует” с биотгш-связанными АТ, тем самым, дополняя четырехслойный "сандвич". Затем вновь инкубировали 30 минут и осуществляли промывку по вышеуказанной методике, для устранения избытка фермента. После третьей инкубации и промывания добавляли раствор субстрата (100 мкл) реагент-Стабилизированный Хромоген, (ТМВ) тетраметилбензидин {он взаимодействует со связанным ферментом с образованием цвета, причем интенсивность окрашивания прямо пропорциональна концентрации 1ЮК5 и ИУЕСР в данных образцах). Жидкость в лунках начинала менять цвет на синий. Инкубировали в течение 30 минут, при комнатной температуре, в темноте. Затем добавлялся Завершающий Раствор (100 мкл) и цвет с синего менялся на желтый. Далее считались данные каждой лунки на микропланшетном ридере при длине волны 450 пт, используя как контроль данные лунки, содержащей по 100 рЬ Стабилизированного Хромогена и Завершающего Раствора': На графической бумаге фиксировались данные стандартов и стандартные концентрации; стандартные кривые для ЮК5 и ;ЬУЕОР строились в координатах: оптическая плотность против концентрации. В неизвестных образцах и контролях определение концентраций ЫЖ5 и ЬУЕОР проводились по построенной стандартной (калибровочной) кривой. Рабочим отрезком, была наиболее близкая к линейной часть кривой. Начало калибровочной кривой, при восстановлении перпендикуляра из этой точки на ось абсцисс, соответствовало значению чувствительности данной тест системы, т.е. минимальному количеству вещества, которое можно определить с ее помощью. Образцы, дающие сигнал больший, чем в наибольшем стандарте (для ШК.5 5000 р^/тЬ, для ЬУЕОР 1500 р^/тЕ) разбавлялись Стандартным Буферным Растворителем (поставляемый реагент) и вновь подвергались анализу. 10 • Точность основывалась на сравнении результатов повторных анализов одного и того же образца в одном опыте (точность внутри исследования образцы с известной концентрацией были исследованы для ОВ5 16 раз, для УПОР 14) и в разных опытах (точность между исследованиями, образцы для ОЯ5 и УЕОР исследовались 42 раза). • Чувствительность. Минимальное определяемое количество вещества для ОК5 составляет < 25 р^/тЬ, для УЕОР < 5р§/тЬ (данные были определены с помощью добавления двух отклонений от значения оптической плотности, полученного, когда нулевой стандарт исследовался 30-кратно). • Линейность разведения. Человеческая сыворотка и субстрат культуры тканей, содержащий 10% фетальной сыворотки теленка были помечены ГОК5 и ЬУЕОР и серийно разбавлены Стандартным Буферным Растворителем, соответственно рангу в исследовании. Линейная регрессия предполагаемой концентрации в анализируемых образцах составила коэффициент корреляции 0,99 в обоих случаях. • Параллелизм был продемонстрирован при сравнении кривых зависимости определяемого вещества от оптической плотности получаемых при анализе разведений стандартной плазмы (рекомбинантный белок) и разведений натуральных ШГС5 и ЬУЕОР в образцах. Выявлено, что стандарт точно отражает содержание натуральных ЬОК5 и ЬУЕОР в плазме. • Специфичность. Буферные растворы ряда веществ с концетрацией до 10,000 р&/тЬ были исследованы с помощью наборов "ВюЗоигсе 1п1етабопа1, 1пс. ЬОК.5" и "ВюЗоигсе 1тетабопа1 1пс. ЬУЕОР". Для первого набора тестировались следующие вещества, где не было обнаружено перекрестной реактивности: ЮЯ4, ТКА1П, РОР кислота, ЕОРК-рецептор эпидермального фактора роста, С-СЗР, ТОР-а, р38 Используемые в нашем исследовании иммунофермеитные тестсистемы, обладали следующими характеристиками: И |