|
3.3. Для определения уровня молекулы клеточной адгезии АЬСАМ использовались реактивы фирмы Я&Э (Англия). Приготовить реагенты, образцы, стандарты. Добавить 100 цл дилюента КГ) 1-35 в каждую ячейку. В каждую ячейку вносим 50цл стандартов и образцов. Инкубируем 2 час в шейкере. После инкубации удаляем содержимое ячеек и промываем 4 раза. Добавляем 200рл конъюгата в каждую ячейку. Инкубируем 2-й раз 2 часа в шейкере. Удаляем содержимое ячеек и промываем 4 раза. Добавляем 200цл субстрата в каждую ячейку. Инкубируем 3-й раз в темноте 30 минут. Добавляем стоп-раствор 50рл в каждую ячейку. Не позднее, чем через 30 минут оцениваем результат на микропланшетном ридере при длине волны 450 нг. Концентрация АЬСАМ в образцах пациента рассчитывается по калибровочной кривой (Рисунок 4). Рисунок 4. Калибровочная кривая при определении МКА АЬСАМ. 4. Ультразвуковое сканирование головного мозга (НСГ) проводили в течение всего времени наблюдения за ребенком с 1-х суток поступления в стационар (среднем 1 раз в 5-7 дней, при необходимости ежедневно; в катамнестическом наблюдении 1 раз в 2-4 недели). Использовали 66 |
вносят по 200 мкл готового раствора субстрата в каждую ячейку,инкубируется в темноте, при комнатной температуре 30 минут. После инкубации в каждую ячейку вносим стоп-раствору содердит 2И серную кислоту)!определяем оптическую плотность ячеек при450 нм не /г* позднее 30 минут после внесения стоп-раствора. Не промывая ячейки вносится по ЮОмкл ГШ№ конъюгата в каждую ячейку. Инкубируются 1 час при комнатной температуре. Концентрация ВЭМР в образцах пациента рассчитывается по калибровочной кривой (Рисунок 2/). Р 1 Рисунок 2.1Калибровочная кривая при определении В1ЖР. 3.3. Принцип метода определения цилиарною нейротрофического фактора (СРГГР). Использовались реактивы фирмы К&Г) (Англия). Моноклональные антитела к СЫТР нанесены в ячейки микропланшета. Стандарты и образцы вносятся в ячейки и присутствующий в них СКТР связывается с антителами. После промывки, удаляющей несвязанные компоненты, вторые антитела к СЬГГР, меченые ферментом, вносятся в 6 Рисунок 5.Калибровочная кривая при определении маркера апоптоза ОК.5. З.бдля определения уровня молекулы клеточной адгезии АЬ^ЛМ использовались реактивы фирмы К&Э (Англия). Приготовить реагенты, образцы, стандарты. Добавить 100 рл дилюента 1Ш1-35 в каждую ячейку. В каждую ячейку вносим 50рл стандартов и образцов. Инкубируем 2 час в шейкере. После инкубации удаляем содержимое ячеек и промываем 4 раза. Добавляем 200рл конъюгата в каждую ячейку. Инкубируем 2-й раз 2 часа в шейкере. Удаляем содержимое ячеек и промываем 4 раза. Добавляем 200рл субстрата в каждую ячейку. Инкубируем 3-й раз в темноте 30 минут. Добавляем стопраствор 50рл в каждую ячейку. Не позднее, чем через 30 минут оцениваем результат на микропланшетном ридере при длине волны 450 нг. Концентрация АМН) в образцах пациента рассчитывается по калибровочной кривой (Рисунок 6.). 13 Рисунок 6. Калибровочная кривая при определении МКА АЬСДМ. 4. Ультразвуковое сканирование головного мозга (НСГ) проводили в течение всего времени наблюдения за ребенком с 1-х суток поступления в стационар (среднем 1 раз в 5-7 дней, при необходимости ежедневно; в катамнестическом наблюдении 1 раз в 2-4 недели). Использовали ультразвуковой аппарат "А!ока 880-630", работающий в режиме реального времени и снабженный датчиками секторного сканирования с частотой 5,0 и 7,5 МГц. Датчик 5 МГц являлся универсальным для проведения исследования у большинства детей. Сканирование с частотой 7,5 МГц позволяло лучше оценивать процессы по конвекситальным отделам полушарий, а также использовалось для исследования у недоношенных новорожденных, имеющих маленькие размеры головы. Результаты нейросонографии, помимо протокола исследования, фиксировались в виде изображений (копирование через принтер) на термобумаге фирмы "8опу". Сканирование проводилось через передний (большой) родничок, во взаимно перпендикулярных плоскостях (сечениях) фронтальных (коронарных), сагитальных и парасагитальных. С целью получения коронарных плоскостей исследования датчик накладывался на область 14 |