Нами было проведено исследование СОД-активности ЦИК в плазме больных РА. При воздействии на плазму смесью этанола, хлороформа и КН2 РО4 с целью осаждения компонентов крови, препятствующих определению СОД было получено, что исходный уровень ЦИК уменьшился « в 2 раза. После осаждения Р ЦИК в супернатанте плазмы 7% ПЭГ концентрация белка составила 852±21,1 мкг/мл, а СОД-активность —2,4±0,35 Ед/мл. Это активность циркулирующих иммунных комплексов, состав которых может быть различен у больных ревматическими заболеваниями, в том числе и СОД—АТ. Сохранение значительной активности растворимой формы СОД можно связать с проявлением СОД-активности образовавшихся иммунных комплексов (СОДраст—АТ). В целом, полученные результаты демонстрируют в основном ингибирующее влияние специфических иммуноглобулинов на ферментативную активность изучаемых энзимов. Тем не менее, антиферментные Ат, как правило, специфичны не по отношению к активному центру энзима, а по отношению к белку в целом. Если антигенные детерминанты фермента расположены вне его активного центра, то последний и в фермент-антиферментном комплексе может оставаться доступным для субстрата (например, 5'-НТ и ПНФ). В случае, когда участки фермента, от которых зависят его антигенные свойства, частично захватывают и область активного центра (например, КАТ и ГДА), антифермент может выступать в качестве ингибитора, конкурирующего с субстратом [29]. 6.2. Изучение влияния регенерации гранулированных антигенных препаратов на свойства иммобилизированных ферментов После проведения определения количества антител к СОД, ГР, КАТ, ЦП, АДА, 5'-НТ, ПНФ, ГДА и КО в сыворотке крови больных РА (п=30 для каждого фермента) иммуноферментным методом гранулы ИГАП подвергались процедуре регенерации по методике, описанной в главе 4. Впоследствии ИГАП повторно использовались для определения специфических антител по вышеописанным методикам. |
Характер взаимодействия Ат с ферментами может быть различен: они могут ингибировать ферментативную активность, усиливать или не изменять ее. Если антигенные группы фермента расположены вне его активного центра, то последний и в фермент-антиферментном комплексе может оставаться доступным для субстрата, сохраняя свою энзиматическую активность. Если же участки фермента, от которых зависят его антигенные свойства, частично охватывают и область активного центра, то антитела к ферменту будут мощным ингибитором, конкурирующим с субстратом. Известны и те, и другие случаи. Например, катехолоксидаза полностью сохраняет активность в комплексе с соответствующим антителом, тогда как лецитиназа утрачивает ее почти целиком. Описано снижение ферментативной активности СОД под влиянием антител к ней [9]. К промежуточным случаям относится взаимодействие антител с уреазой, папаином, рибонуклеазой, которые сохраняют.свою активность частично [16, 17]. Возможно также и усиление активности энзимов в результате взаимодействия со специфическими антителами. Отмечено, что специфические иммуноглобулины помимо повышения истинной ферментативной активности каталазы, защищают ее от действия ингибиторов, ультрафиолетового облучения и нагревания [71]. Имеются сообщения об обнаружении антинейтрофильных цитоплазматических антител (АНЦА) при сегментарном некротизирующем гломерулонефрите, СКВ, гранулематозе Вегенера и других системных васкулитах, которые могут связываться с мембраноассоциированной формой миелопероксидазы [5, 41]. Такое взаимодействие активирует миелопероксидазу как in vitro, так и in vivo и приводит к повышенной продукции кислородных радикалов и стимуляции перекисного окисления липидов. Крупные естественные белковые молекулы, к которым можно отнести и многие ферменты, обладают несколькими детерминантными группировками, причем число их увеличивается пропорционально возрастанию молекулярной массы белковых молекул. Количество детерминантных групп на молекуле белка имеет существенное значение для реализации ее антигенности. Различные Полученные результаты демонстрируют в основном ингибирующее влияние специфических иммуноглобулинов на ферментативную активность изучаемых энзимов. Тем не менее, антиферментные Ат, как правило, специфичны не по отношению к активному центру энзима, а по отношению к белку в целом. Если антигенные детерминанты фермента расположены вне его активного центра, то последний и в фермент-антиферментном комплексе может оставаться доступным для субстрата (5'-НТ и ПНФ). В случае, когда участки фермента, от которых зависят его антигенные свойства, частично захватывают и область активного центра (ГДА), антифермент может выступать в качестве ингибитора, конкурирующего с субстратом [16]. 5.2. Изучение влияния регенерации магнитоуправляемых сорбентов на свойства иммобилизированных ферментов После проведения определения количества антител к 5'-НТ, ПНФ и ГДА в сыворотке крови больных РА (п=30 для* каждого фермента) иммуноферментным методом гранулы МС подвергались процедуре регенерации погметодике; описанной’в главе 3. Впоследствии МС повторно использовались для определения специфических антител по вышеописанной методике. Исследование изменения сорбционной ёмкости МС после регенерациии не выявило достоверного снижения иммунохимическои активности магнитосорбента (для 5'-НТ до регенерации сорбционная ёмкость составила 4,38±0;69, после 3,87±0,48, р>0,05; для ПНФ до регенерации сорбционная ёмкость составила 3,45±0,52, после —3,02±0,47, р>0;05; для ГДА до регенерации сорбционная ёмкость составила 3,66±0,29, после 3,48±0,45, р>0,05). Таким образом, МС с иммобилизированными ферментами (5'-НТ и ПНФ) могут эффективно регенерироваться без потери ими иммунохимических свойств, что позволяет неоднократно использовать данные МС в методах иммуноанализа. |