|
Методом иммунофлуоресценции была обнаружена локализация фермента в цитоплазме лимфобластов и фибробластов человека и его полное отсутствие в ядре. Наряду с другим ферментом пуринового метаболизма аденозиндезаминазой, ПНФ обнаружена в эндотелиальных и глиальных нервных клетках цыпленка и крысы с полным отсутствием активности фермента в нейронах [176]. Активность ПНФ в эндотелиальных клетках мелких сосудов головного мозга быка в 247 раз выше, чем непосредственно в тканях. С учетом субстратной специфичности фермента, ПНФ, также как и АДА, может являться своеобразным ферментативным гематоэнцефалическим барьером для некоторых дидеоксинуклеозидов, обладающих анти-HIV действием [223]. ПНФ, выделенная из эритроцитов человека и теленка, является тримерным [130, 170, 254]. Её молекулярная масса в зависимости от метода определения находится в пределах 63000 —71000'Да. По*данным электрофореза в присутствии додецилсульфата Na фермент состоит из двух субъединиц молекулярной массой 33 000 Да. ПНФ кодируется 6 аксоном человеческой хромосомы 14ql3 [300]. Молекула ПНФ имела массу, равную 94000 Да, и состояла из.3-х ассиметрично расположенных субъединиц с молекулярной массой 31000 —32000 Да [182]. Следует > отметить, что блокирование SH-групп фермента приводит к полной потере его каталитической активности. Человеческая ПНФ высокоспецифичный фермент для 6-оксипуриновых нуклеозидов с каталитической эффективностью для инозина в 350 000 раз больше, чем для аденозина [195, 321]. Химические замещения в пуриновом кольце пуриновых рибонуклеозидов приводили к изменению субстратной специфичности: введение тиоили метилтио-групп в положениях (6) или (2) повышало сродство фермента к нуклеозидам в 20 раз. Увеличение количества первичных аминогрупп (в 8-аминоаденозине или 2-аминоаденозине) повышало сродство к ПНФ, тогда как увеличение количества гидроксильных групп (в ксантозине или 8-оксигуанозине) вызывало уменьшение способности соединений связываться с ферментом. Такие аналоги как 7-деазааденозин и 7-деазаинозин не выступали в роли доноров или акцепторов рибозильного остатка и оказывали ингибирующее действие на ПНФ. |
Изменение концентрации фосфата в данной реакции регулирует уровни и соотношение рибозо-5и рибозо-1-фосфатов, что имеет важное значение для образования фосфорибозилпирофосфата, одного из первых промежуточных продуктов синтеза ПН de novo, и использования рибозо-1-фосфатов при повторном биосинтезе нуклеозидов. ПНФ широко распространена в природе: фермент обнаружен у бактерий, птиц, млекопитающих [86, 97, 154]. ПНФ встречается во всех тканях, но в большей степени в периферических гранулоцитах и лимфоидной ткани, что связывает ее с развитием Т-клеточного иммунитета [156]. ПНФ присутствует во всех дифференцированных Т-клетках и считается индуктором супрессорной функции этих клеток. Установлено, что процесс дифференциации лимфоидных клеток непосредственно связан с изменением активности ферментов, участвующих в деградации пуринов. В процессе созревания тимоцитов активность ПНФ изменяется в направлении противоположном активности аденозиндезаминазы (АДА): кортикальные тимоциты с высокой активностью АДА обладают низкой активностью ПНФ, а зрелые медулярные и селезеночные лимфоциты1с более низкой активностью АДА имеют сравнительно высокую активность ПНФ. Методом иммунофлуоресценции была обнаружена локализация фермента в цитоплазме лимфобластов и фибробластов человека и его полное отсутствие в ядре. Наряду с другим ферментом пуринового метаболизма аденозиндезаминазой, ПНФ обнаружена в эндотелиальных и глиальных нервных клетках цыпленка и крысы с полным отсутствием активности фермента в нейронах [95]. Активность ПНФ в эндотелиальных клетках мелких сосудов головного мозга быка в 247 раз выше, чем непосредственно в тканях. С учетом субстратной специфичности фермента, ПНФ, также как и АДА, может являться своеобразным ферментативным гематоэнцефалическим барьером для некоторых дидеоксинуклеозидов, обладающих анти-ШУ действием [125]. Для очищенной ПНФ из печени цыпленка оптимум активности наблюдался при рН=6,0. Фермент полностью инактивировался при 120°С за 48 часов, а при 14°С за тоже время терял лишь 10% своей активности. В присутствии мителеновой сини ПНФ обнаружил высокую чувствительность к фотоокислению и зависимость фотоинактивации от pH. Обработка фермента из печени теленка и эритроцитов человека 2,3-бутадионом или фенилглиоксалем приводило к значительному снижению активности ПНФ. Неорганический фосфат, рибозо-1фосфат и инозин защищали энзим от инактивации этими реагентами. ПНФ Е.соН имеет две формы —высокомолекулярную и низкомолекулярную, отличающихся между собой четвертичной структурой фермента и субстратной специфичностью [154]. Низкомолекулярная форма энзима имеет тримерную структуру с молекулярной массой сооственно энзима йэиии , субъединицы 28000 Да и проявляет специфичность ко всем природным пуриновым нуклеозидам. В тоже время, высокомолекулярная форма ПНФ имеет гексамерную структуру с молекулярной массой нативного белка 150000 Да, одной субъединицы 25000 Да и не расщепляет нуклеозиды аденина. Аденозин является неконкурентным ингибитором гексамерной формы ПНФ по отношению к дезоксигуанозину. В отличие от ПНФ E.coli, фермент, выделенный из эритроцитов человека и теленка, является тримерным [65, 90, 143]. Его молекулярная масса в зависимости от метода определения находится в пределах 63000 71000 Да. По данным электорофореза в присутствии додецилсульфата Na фермент состоит из двух субъединиц молекулярной массой 33 000 Да. ПНФ кодируется 6 аксоном человеческой хромосомы 14ql3 [174]. Выращенные в 40% растворе сульфата аммония кристаллы ПНФ, очищенной из эритроцитов человека, имели форму, зависящую от pH. В диапазоне pH 5,3—5,9 были получены ромбовидные кристаллы, стабильные к действию рентгеновских лучей, а при pH свыше 6,0 формировались стержнеобразные кристаллы фермента, непригодные для анализа с помощью данного метода. <г t Молекула ПНФ имела массу, равную 94000 Да, и состояла из 3-х ассиметрично «С расположенных субъединиц с молекулярной массой 31000 —32000 Да [99]. Следует отметить, что блокирование SH-групп фермента приводит к полной потере его каталитической активности. t к •г S 4 Г * 4 4 *4» * * 5 * £9 s 1C ♦ к ✓ * Присутствие фосфата в каталитической триаде (Glu89-His86-P04) ПНФ эритроцитов человека объясняет недостаточную гидролитическую активность ПНФ и является особой чертой механизма, дифференцирующего фосфорилазы от гликозидаз [108]. В процессе фосфоролитической реакции в присутствии фосфата образуется* переходный комплекс фермента с гипоксантином (3 молекулы гипоксантина на гримерную молекулу ПНФ), который кристаллизуется в кубическую пространственную группу с локализацией биологически активного тримера в центре 3-мерной кристаллографической оси [Ч 199]. Человеческая ПНФ высокоспецифичный фермент для 6-оксипуриновых ё нуклеозидов с каталитической эффективностью для инозина в 350 000 раз больше, чем для аденозина [109,189].* щ Химические замещения в пуриновом кольце пуриновых рибонуклеозидов приводили к изменению субстратной специфичности: введение тиоили метилтио-групп в положениях (6) или (2) повышало сродство фермента.к нуклеозидам в 20 раз. Увеличение количества первичных аминогрупп (в 8аминоаденозине или 2-аминоаденозине) повышало сродство к ПНФ, тогда как увеличение количества гидроксильных групп (в ксантозине или 8оксигуанозине) вызывало уменьшение способности соединений связываться с ферментом. Такие аналоги как 7-деазааденозин и 7-деазаинозин не выступали в роли доноров или акцепторов рибозильного остатка, и оказывали ингибирующее действие на ПНФ. \ ft & * Для обнаружения непосредственно ПНФ в одной клетке предложен метод непрямой иммунофлуоресценции, имеющий важное значение для определения мутантного ферментного белка при недостаточности последнего, поскольку сам метод не связан с определением активности энзима. О дефиците фермента ■ч 1 |