|
ЧАСТЬ П. СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ ГЛАВА 4. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ 4.Т. Получение образцов исследуемого материала При проведении иммунологических и биохимических исследований образцов крови ее забор осуществляли при пункции вены в утренние часы натощак. Кровь забиралась в объеме 3—5 мл и в стеклянных пробирках помещалась в термостат (37±1°С) на 60±5 минут для, формирования и ретракции сгустка. Затем стеклянной палочкой отделяли аусток от стенок пробирки и центрифугировали образцы в течение 15 мин при 3000 оборотов/мин (лабораторная центрифуга ЦЛК-1): После чего отбирали^сыворотку и помещали ее в аликвотах по 0,5 мл в пластиковые микроцетрифужные пробирки,типа Eppendorf, которые хранили до* момента анализа при -24°С. При,проведении преаналитического этапа исследования придерживались следующих правил: •для исключения1ложноположительных результатов исследуемые сыворотки готовили и*хранили.в условиях, исключающих возможность бактериального пророста; • образцы сывороток, содержащие осадок и агрегаты, осветляли путем центрифугирования; • не использовали сыворотки с выраженным гемолизом, гиперлипидемией и бактериемией; • повторного размораживания и замораживания образцов не допускалось; • каждый образец сыворотки отбирался новым наконечником; • для отбора исследуемых проб (при проведении исследования) применялись автоматические пипетки с погрешностью измерения объема не более 5%. |
ЧАСТЬ И. СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ ГЛАВА 3. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИИ 3.1. Получение образцов исследуемого материала При проведении иммунологических и биохимических исследований образцов крови ее забор осуществляли при пункции вены в утренние часы натощак. Кровь забиралась в объеме 3—5 мл и в стеклянных пробирках помещалась в термостат (37±1°С) на 60±5 мин. для формирования и ретракции сгустка. Затем стеклянной палочкой отделяли сгусток от стенок пробирки и центрифугировали образцы в течение 15 мин при 3000 оборотов/мин (лабораторная центрифуга ЦЛК-1). После чего отбирали сыворотку и помещали ее в аликвотах по 0,5 мл в пластиковые микроцетрифужные пробирки типа Eppendorf, которые хранили до момента анализа при -24°С. Повторного размораживания и замораживания образцов не допускалось. 3.2. Характеристика антигенов В качестве антигенов использовались коммерческие препараты исследуемых ферментов производства фирмы «Sigma» (США): 1. Препарат 5 -нуклеотидазы (ЕС 3.1.3.5) из яда гремучей змеи (5'-Nucleotidase from Crotalus atrox venom; Cat. № N5880) представляет собой лиофилизированный порошок с активностью 100 Ед. В одном флаконе содержится 0,96 мг сухого вещества (0,32 мг белка и 0,64 мг глицинового буфера) с активностью фермента 110 ЕД/мг сухого вещества или 330 ЕД/мг белка (биуретовый метод). 1ЕД энзима гидролизировала 1 мкмоль неорганического фосфата из аденозин 5'монофосфата в минуту при рН=9,0 и температуре 37°С. В ELISAтесте использовался фермент в разведении 15 мкг/мл. 2. Препарат пуриннуклеозидфосфорилазы (ЕС 2.4.2.1) из крови человека (Nucleoside Phosphorylase from human blood; Cat. № N3514) представляет собой лиофилизированный порошок с активностью 130 Ед/мг, концентрация белка |