|
4.2. Характеристика антигенов В качестве антигенов использовались коммерческие препараты исследуемых ферментов производства фирмы «Sigma» (США): 1. препарат супероксидцисмутазы из эритроцитов человека (Superoxide Dismutase from human erythrocytes; Cat. № S 9636), представляющий собой лиофилизированный порошок с активностью 3000 Ед/мг, концентрация белка в нем составила 98 мг/мл (биуретовый метод). В’ELISA-тесте использовался фермент в разведении 10 мкг/мл. 2 . препарат глутатионредуктазы (Glutathione Reductase from Baker's yeast; Cat. № G 3664), представляющий собой суспензию в 3,6 M растворе сульфата аммония (рН=7,0) с активностью 240 ЕД/мг белка (биуретовый метод). В ELISA-тесте использовался фермент в разведении 2 0 мкг/мл. 3. препарат каталазы из эритроцитов человека (Catalase from human erythrocytes; Cat. № C 3556), представляющий собой водный'раствор (рН=5,4) с активностью 4000 ЕД/мг белка (биуретовый метод). В ELISA-тесте использовался фермент в разведении 20 мкг/мл. 4. препарат аденозиндезаминазы из печени быка (Adenosine Deaminase from bovine spleen, Cat. № A 5043), представляющий собой 50% раствор глицерола, с активностью 130 Ед/мг, концентрация белка в нем составила 95,6 мг/мл. 1 ЕД энзима дезаминировала 1 мкмоль аденозина в инозин в минуту при рН=7,5 и температуре 25°С. В ELISA-тесте использовался фермент в разведении 10 мкг/мл. 5. препарат 5-нуклеотидазы из яда гремучей змеи (5'-Nucleotidase from Crotalus atrox venom; Cat. № N 5880), представляющий собой лиофилизированный порошок с активностью 100 Ед. В одном флаконе содержится 0,96 мг сухого вещества (0,32 мг белка и 0,64 мг глицинового буфера) с активностью фермента 110 ЕД/мг сухого вещества или 330 ЕД/мг белка (биуретовый метод). 1 ЕД энзима гидролизировала 1 мкмоль неорганического фосфата из аденозин 5'монофосфата в минуту при рН=9,0 и температуре 37°С. В ELISA-тесте использовался фермент в разведении 15 мкг/мл. |
ЧАСТЬ И. СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ ГЛАВА 3. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИИ 3.1. Получение образцов исследуемого материала При проведении иммунологических и биохимических исследований образцов крови ее забор осуществляли при пункции вены в утренние часы натощак. Кровь забиралась в объеме 3—5 мл и в стеклянных пробирках помещалась в термостат (37±1°С) на 60±5 мин. для формирования и ретракции сгустка. Затем стеклянной палочкой отделяли сгусток от стенок пробирки и центрифугировали образцы в течение 15 мин при 3000 оборотов/мин (лабораторная центрифуга ЦЛК-1). После чего отбирали сыворотку и помещали ее в аликвотах по 0,5 мл в пластиковые микроцетрифужные пробирки типа Eppendorf, которые хранили до момента анализа при -24°С. Повторного размораживания и замораживания образцов не допускалось. 3.2. Характеристика антигенов В качестве антигенов использовались коммерческие препараты исследуемых ферментов производства фирмы «Sigma» (США): 1. Препарат 5 -нуклеотидазы (ЕС 3.1.3.5) из яда гремучей змеи (5'-Nucleotidase from Crotalus atrox venom; Cat. № N5880) представляет собой лиофилизированный порошок с активностью 100 Ед. В одном флаконе содержится 0,96 мг сухого вещества (0,32 мг белка и 0,64 мг глицинового буфера) с активностью фермента 110 ЕД/мг сухого вещества или 330 ЕД/мг белка (биуретовый метод). 1ЕД энзима гидролизировала 1 мкмоль неорганического фосфата из аденозин 5'монофосфата в минуту при рН=9,0 и температуре 37°С. В ELISAтесте использовался фермент в разведении 15 мкг/мл. 2. Препарат пуриннуклеозидфосфорилазы (ЕС 2.4.2.1) из крови человека (Nucleoside Phosphorylase from human blood; Cat. № N3514) представляет собой лиофилизированный порошок с активностью 130 Ед/мг, концентрация белка в нем составила 95 мг/мл (биуретовый метод). 1 ЕД энзима фосворолизирует 1мкмоль инозина до гипоксантина и рибозо-1-фосфата в минуту при рН=7,4 и температуре 25°С. В ELISA-тесте использовался фермент в разведении 10 мкг/мл. 3. Препарат гуаниндезаминазы (ЕС 3.5.4.3) из печени кролика (Guanase from rabbit liver; Cat. № G5752) представляет собой суспензию в 3,2 М растворе сульфата аммония (рН=6,0) с активностью 0,2 ЕД/мг белка (биуретовый метод). 1 ЕД энзима деаминирует 1 мкмоль гуанина в ксантин в минуту при рН=8,0 и температуре 25°С. В ELISA-тесте использовался фермент в разведении 5 мкг/мл. 3.3. Иммобилизация ферментов Для получения иммобилизированных форм изучаемых ферментов использовали растворы с соответствующей концентрацией: для* 5'-НТ 100 мкг/мл; для ПНФ —50 мкг/мл; для ГДА —20 мкг/мл. Учитывая достаточную' относительную молекулярную массу используемых в исследовании ферменг тов (5'-НТ 60-120 кДа; ПНФ 90-92 кДа; ГДА 100-120 кДА), иммобилизацию проводили методом эмульсионной полимеризации в модификации. И.П.Гонтаря с соавт. в потоке газообразного азота с включением в структуру гранул магнитного материала [12]. После завершения полимеризации полученные гранулы магнитосорбентов в течение 15-20 мин отмывали ацетоном и физиологическим раствором с детергентом твин-20 (0,05%) от непрореагировавших мономеров, эмульгатора и гексана. Магнитосорбенты на основе 5'-НТ, ПНФ и ГДА имели правильную сферическую форму с размером частиц от 10 до 100 мкм. Процедура иммобилизации 5'-НТ,.ГДА и ПНФ не вызывала изменения биологических свойств ферментов (активность растворимой формы 5'-НТ составила 75,5±3,69 Ед, иммобилизированной 69,6±4,22 Ед; растворимой формы ПНФ 66,4±3,99 Ед, иммобилизированной 60,7±3,12 Ед; раство |