|
Учитывая достаточную относительную молекулярную массу используемых в исследовании ферментов (ГР 50-55 кДа, ЦП 132 кДа, КАТ 240 кДа, АДА 36 кДа, 5'-НТ 60-120 кДа; ПНФ 90-92 кДа; ГДА 100-120 кДА; КО 300 кДа), иммобилизацию проводили методом эмульсионной полимеризации в модификации И.П.Гонтаря с соавт. в потоке газообразного азота с включением в структуру гранул магнитного материала [24]. Беря во внимание небольшую относительную молекулярную массу эритроцитарной СОД ( < 30 кДа.) и данные литературы о возможной диффузии биологических макромолекул с подобной молекулярной массой [41], иммобилизацию фермента проводили путем пришивки его молекулы глютаровым альдегидом к инертной полиакриламидной грануле, содержащей магнитный материал. Иммобилизацию осуществляли по методу, описанному A.CJohansson et all. (1974) [222]. Было определено, что максимальная сорбция СОД на гранулы, активированные глютаровым альдегидом, составила 980 мкг белка на 1 мл (70%). Рисунок 8 . Микрофотография полиакриламидных гранул с магнитным материалом. По завершению полимеризации гранулы магнитосорбентов в течение 15-20 мин отмывали ацетоном и физиологическим раствором с детергентом твин-20 (0,05%) от непрореагировавших мономеров, эмульгатора и гексана. |
в нем составила 95 мг/мл (биуретовый метод). 1 ЕД энзима фосворолизирует 1мкмоль инозина до гипоксантина и рибозо-1-фосфата в минуту при рН=7,4 и температуре 25°С. В ELISA-тесте использовался фермент в разведении 10 мкг/мл. 3. Препарат гуаниндезаминазы (ЕС 3.5.4.3) из печени кролика (Guanase from rabbit liver; Cat. № G5752) представляет собой суспензию в 3,2 М растворе сульфата аммония (рН=6,0) с активностью 0,2 ЕД/мг белка (биуретовый метод). 1 ЕД энзима деаминирует 1 мкмоль гуанина в ксантин в минуту при рН=8,0 и температуре 25°С. В ELISA-тесте использовался фермент в разведении 5 мкг/мл. 3.3. Иммобилизация ферментов Для получения иммобилизированных форм изучаемых ферментов использовали растворы с соответствующей концентрацией: для* 5'-НТ 100 мкг/мл; для ПНФ —50 мкг/мл; для ГДА —20 мкг/мл. Учитывая достаточную' относительную молекулярную массу используемых в исследовании ферменг тов (5'-НТ 60-120 кДа; ПНФ 90-92 кДа; ГДА 100-120 кДА), иммобилизацию проводили методом эмульсионной полимеризации в модификации. И.П.Гонтаря с соавт. в потоке газообразного азота с включением в структуру гранул магнитного материала [12]. После завершения полимеризации полученные гранулы магнитосорбентов в течение 15-20 мин отмывали ацетоном и физиологическим раствором с детергентом твин-20 (0,05%) от непрореагировавших мономеров, эмульгатора и гексана. Магнитосорбенты на основе 5'-НТ, ПНФ и ГДА имели правильную сферическую форму с размером частиц от 10 до 100 мкм. Процедура иммобилизации 5'-НТ,.ГДА и ПНФ не вызывала изменения биологических свойств ферментов (активность растворимой формы 5'-НТ составила 75,5±3,69 Ед, иммобилизированной 69,6±4,22 Ед; растворимой формы ПНФ 66,4±3,99 Ед, иммобилизированной 60,7±3,12 Ед; раство |