|
В итоге были получены гранулированные антигенные препараты, представляющие собой двойные полиакриламидные гранулы правильной сферической формы с размером частиц от 10 до 100 мкм (см. рисунок 8). Средний диаметр гранул составил 55±6,8 мкм (при соотношении полимерный носитель : железо 2 : 1, в пересчете на сухую массу). Гранулы имели длительный срок хранения (до 2-х лет); после регенерации они были пригодны для повторного использования. Процедура иммобилизации СОД, ГР, КАТ, ЦП, АДА, ГДА, 5'-НТ, ПНФ и КО не вызывала изменения биологических свойств ферментов (см. таблицу 3). Таблица 3. Влияние иммобилизации на биологические свойства ферментов Фермент Ферментативная активность Иммобилизированная форма Растворимая форма СОД,Ед 37,3 ±0,19 37,5 ± 0,08 ГР, Ед 128,1 ± 0,1 128,4 ±0,11 КАТ, мКАТ/л * 24,6±1,02 24,9±1,04 ЦП,Ед 45,6±1,02 45,9±1,04 АДА, Ед/мл 57,6±1,72 61,9±1,64 5'-НТ, ЕД/л 69,6±4,22 75,5±3,69 ПНФ, мкмоль/л/мин 60,7±3,12 66,4±3,99 ГДА, МЕ/л 58,6±3,63 62,2±4,41 КО, мкмоль/л х мин 62,1+3,44 67,2±3,94 Активность иммобилизированной формы.ферментов сохранялась более 1,5 года, в то время как для растворимой формы энзимов было отмечено существенное снижение активности уже через 3-4 месяца. Кроме того, иммобилизация повышает устойчивость ферментов к воздействию высоких температур: после автоклавирования активность растворимых форм изучаемых ферментов снизилась практически до нуля, а иммобилизированных — незначительно (для СОД уменьшилась на 8,52%, для ГР уменьшилась на 6,22%, Ш для КАТ уменьшилась на 6,87%, для ЦП уменьшилась на 4,71%, для АДА умень |
римой формы ГДА —62,2+4,41 Ед, иммобилизированной —58,6±3,63 Ед). Кроме того, иммобилизация повышает устойчивость ферментов к воздействию высоких температур: после автоклавирования активность растворимых форм изучаемых ферментов рованных незначительно уменьшилась на 6,03 %, для ПНФ уменьшилась на 11,69 %, для ГДА уменьшилась на 9,89 %). 3.4. Оригинальные иммунологические методы исследования Учитывая, что модифицированная методика иммуноферментного анализа с использованием магнитосорбентов имеет очевидные преимущества перед методиками, использующими в качестве твердой фазы полистироловый планшет [13, 57], при проведении исследований, направленных на изучение процессов антителогенеза к ферментам ПМ, предпочтение было отдано ИФА с иммобиллизированными магнитосорбентами. Различия в результатах при использовании различных вариантов ИФА могут быть объяснены с точки зрения свойств адсорбции белка на полистироле* (классический ИФА на полистироловых планшетах) и включения белка в структуру геля (модификация ИФА с использованием МС) и кинетики реакции: образования комплекса антиген-антитело на разделе фаз. При постановке иммуноферментного анализа с использованием MG наблюдается повышение аффинности, связанное с разделением фаз и повышением локальной эффективной концентрации связывающих участков антигена на разделе фаз, а также существенное увеличение концентрации антигена при уменьшении объема реагентов. Кроме того, помещение гранул с магнитными свойствами в переменное магнитное поле вызывает перемещение фаз друг относительно друга, в результате чего вероятность встречи антигенраспознающего центра антител, находящихся в жидкой фазе, с антигеном, фиксированном на твердой фазе, повышается. Также этим достигается перемешивание компонентов системы, предотвращающее неравномерность распределения компонентов в растворе, что в итоге |