|
ляемых антител. Реакцию останавливали добавлением 100 мкл 5% раствора H2 SO4 , после чего гранулы магнитосорбента удаляли из лунок. 4.4.3. Определение антител к СОД, ГР и 5 Г-Н Т Оптимальные условия проведения иммуноферментного метода для определения Ат к СОД, ГР и 5'-НГ были подобраны экспериментально и практически не отличались друг от друга, поэтому были проведены по единой схеме. Анализ проводился в полистироловых планшетах Immulon 2 (Dynatech Labs, Германия). На первом этапе в лунки планшета вносили по 150 мкл 2% бычьего сывороточного альбумина в ЗФР для предотвращения неспецифического связывания белка с полистироловой поверхностью. После 1 часа инкубации при 37°С планшеты промывали ЗФРТ и вносили по 100 мкл 10% взвеси гранулированного препарата с иммобилизированным ферментом (СОД, ГР и 5'-НТ, соответственно), выполняющим роль специфического антигена, и по 100 мкл исследуемых сывороток (в дубликатах), разведенных 1% БСА до концентрации 1:100. Параллельно ставили контроль на субстрат и конъюгат. Через 1 час инкубации при 37°С и отмывки 5 раз по 3 минуты» в каждый планшет вносили афинно очищенные антитела против иммуноглобулинов G человека, меченые пероксидазой, в рабочем разведении 1:1000, указанном фирмойизготовителем (Sigma, США). После инкубации на магнитной мешалке (1 час при 37°С) и отмывки (5 раз по 3 минуты) в лунки планшета вносили по 100 мкл субстрата (3,3',5,5'-тетраметилбензидин в цитратно-фосфатном буфере с Н2О2) и выдерживали 15-30 мин при 18-25°С. При правильной постановке в контрольных лунках реакция не развивалась. В опыте появлялось синее окрашивание, интенсивность которого возрастала с увеличением количества выявляемых антител. Реакцию останавливали добавлением 100 мкл 5% раствора H2SO4, после чего гранулы магнитосорбента удаляли из лунок. 4.4.4. Определение антител к ксантиноксидазе Анализ проводился в полистироловых планшетах Immulon 2 (Dynatech Labs, Германия). На первом этапе в лунки планшета вносили по 150 мкл 2% бычьего |
способствует смещению реакции антиген —антитело в направлении образования комплекса. 3.4.1. Определение антител к 5'-НТ иммуноферментным методом с использованием иммобилизированной формы магнитоуправляемого сорбента Анализ проводился в полистироловых планшетах Immulon 2 (Dynatech Labs, Германия). На первом этапе в лунки планшета вносили по 150 мкл 2% бычьего сывороточного альбумина в ЗФР для предотвращения неспецифического связывания белка с полистироловой поверхностью. После 1 часа инкубации при 37 С планшеты промывали ЗФРТ и вносили по 100 мкл 10% взвеси гранулированного магнитосорбента с иммобилизированной 5'-НТ, выполняющей роль специфического антигена, и по 100 мкл исследуемых сывороток (в дубликатах),.разведенных 1% БСА до концентрации 1:100. Параллельно ставили контроль на субстрат и конъюгат. Через 1 час инкубации при 37°G и отмывки 5 раз по 3 минуты в каждый планшет вносили афйнно очищенные антитела против иммуноглобулинов G человека, меченые пероксидазой, в-рабочем разведении 1:1000, указанном фирмой-изготовителем (Sigma, США); После инкубации на магнитной мешалке (Г час при 37°С) и отмывки (5 раз по 3 минуты) в лунки планшета вносили по 100 мкл субстрата (3,3',5,5'-тетраметилбензидин в цитратно-фосфатном буфере с перекисью водорода) и выдерживали Г5-30 мин при комнатной температуре (18-25°С). При правильной постановке в контроль* ных лунках реакция не развивалась. В опыте появлялось синее окрашивание, интенсивность которого возрастала с увеличением количества выявляемых антител. Реакцию останавливали добавлением 100 мкл 5% раствора H2S04, после чего гранулы магнитосорбента удаляли из лунок. Результаты учитывали на многоканальном микропланшетном спектрофотометре при длине волны 450 нм, полученные значения выражали в единицах оптической плотности, для получения которых от среднего значения измерен ных оптических плотностей исследуемого образца вычитали среднее значение фона, измеренного в лунках, в которые вместо исследуемых образцов помещали аналогичный объем 0,01М фосфатного буферного раствора (pH 7,4), содержавшим 1% БСА. 3.4.2. Определение антител к ПНФ и Г ДА иммуноферментным методом с использованием иммобилизированных форм магнитоуправляемого сорбента Оптимальные условия проведения иммуноферментного метода для определения антител к ПНФ и ГДА были подобраны экспериментально и практически не отличались друг от друга, поэтому были проведены по единой схеме. Анализ проводился в полистироловых планшетах Immulon 2 (Dynatech Labs, Германия). Неспецифическое связывание блокировали инкубацией 1% раствором бычьего сывороточного альбумина (БСА) на карбонатбикарбонатном буферном растворе (рН=9,6). Затем в лунки планшета вносили по 100 мкл 50% взвеси гранулированного магнитосорбента с иммобилизированным ферментом (ПНФ и ГДА, соответственно). Исследуемая сыворотка больных и доноров разводилась 1:200 в 0,01М фосфатном буферном растворе (pH 7,4), содержавшим 1% БСА и вносилась в дубликатах по 200 мкл в лунки микротитрационного планшета, параллельно ставили контроль на субстрат и конъюгат. Инкубацию планшета проводили в течение 120±3 мин при 24±1°С на магнитной мешалке для активного перемешивания гранул, после чего выполнялась пятикратная отмывка ЗФР с добавлением 0,05% Твин-20. Для'выявления связавшихся аутоантител использовали антитела диагностические против иммуноглобулинов человека, меченные пероксидазой хрена производства НИИЭМИ им. Гамалеи. Иммунопероксидазный комплекс (ИПК), растворенный в 2% БСА на 0,01 М фосфатном буфере (pH 7,4), использовали в рабочем разведении 1:400, которое определяли в предварительных опытах, и вносили по 100 мкл в каждую лунку. Последующая инкубация с ИПК составляла 1 час при 24±1°С на магнитной мешалке, затем планшет промывали трижды раствором |