|
I I 1 P сывороточного альбумина в ЗФР для предотвращения неспецифического связыч 4 ч вания белка с полистироловой поверхностью. После 1 часа инкубации при 37°СР \ 4 ь * v V планшеты промывали ЗФРТ и вносили по 100 мкл 10% взвеси гранулированного * 4 Г препарата.с иммобилизированной КО; выполняющей роль специфического анти1 ' ‘ гена,,и по 100 мкл исследуемых сывороток (в дубликатах), разведенных 1% EGAi h ■ 4 до концентрации 1:100: Параллельно ставили, контроль на субстрат и конъюгат.f ■ ч I f Через 1 час,'инкубации при 24°С и отмывки 5 раз по 3 минуты в каждую лункуь , Ф ♦ ь в Щ планшета,вносили афинно очищенные антитела против иммуноглобулинов G. че■* ч w • \ ф ловека,.меченые пероксидазой, в рабочем разведении Г:1000, указанном фирмой-' ч * * * * » * 'ь изготовителем'(Sigma, США). После инкубации на магнитной мешалке (1 час.приt I * А * 24°G) и отмывки (5 раз по 3 минуты) в лунки планшета вносили по 100 мкл суб-^ * v . 1 1 , * страта (3,3',"5,5'-тетраметилбензидин в цитратно-фосфатном буфере с Н2О2) и выдерживали 15-30 мин при 18-25°С. При правильной постановке: в контрольныхр ш Р . I 4 I и i лунках реакция: не развивалась. В опыте появлялось синее окрашивание, интен-» » сивность которого возрастала с увеличением количества,выявляемых антител. Ре, . . . * * акциюгостанавливали добавлением 1005мкл 5% раствора H2SO4, после чего полиакриламидные гранулы,удаляли из лунок.. I Результаты учитывали на многоканальном:микропланшетном спектрофото-• ь Р « % ь * ' метре «Multiskan ЕХ» (Thermo, Electron Corporation);при'длине волны 405 нм, по-* ** I •I лученные значения выражали в единицах оптической плотности (Ед), для получения;которых от среднего значения :измеренных оптических плотностей исследуе-• ■ I •л « * I г _ * *I мого образца:вычитали среднее значение фона (лунки с аналогичным объем фос-• 1 « • ч г фатного буферного раствора, содержащего EGA); Наличие антител считалось по-ч Г _ к 1 ложительным при превышении значений оптической плотности на 2 стандартных отклонения от средних значении контрольной группы » I 4i4.5. Сравнение иммуноферментной ииммунофлуоресцентной мето-. * * ' ■ ' f * . дик дпределенияшнтителшвыбор предпочтительной методики Л ди иммунологических: методов диагностики антител в, ревматологии 1 наибольшее распространение получили иммуноферментный (ИФА) и иммунофч |
способствует смещению реакции антиген —антитело в направлении образования комплекса. 3.4.1. Определение антител к 5'-НТ иммуноферментным методом с использованием иммобилизированной формы магнитоуправляемого сорбента Анализ проводился в полистироловых планшетах Immulon 2 (Dynatech Labs, Германия). На первом этапе в лунки планшета вносили по 150 мкл 2% бычьего сывороточного альбумина в ЗФР для предотвращения неспецифического связывания белка с полистироловой поверхностью. После 1 часа инкубации при 37 С планшеты промывали ЗФРТ и вносили по 100 мкл 10% взвеси гранулированного магнитосорбента с иммобилизированной 5'-НТ, выполняющей роль специфического антигена, и по 100 мкл исследуемых сывороток (в дубликатах),.разведенных 1% БСА до концентрации 1:100. Параллельно ставили контроль на субстрат и конъюгат. Через 1 час инкубации при 37°G и отмывки 5 раз по 3 минуты в каждый планшет вносили афйнно очищенные антитела против иммуноглобулинов G человека, меченые пероксидазой, в-рабочем разведении 1:1000, указанном фирмой-изготовителем (Sigma, США); После инкубации на магнитной мешалке (Г час при 37°С) и отмывки (5 раз по 3 минуты) в лунки планшета вносили по 100 мкл субстрата (3,3',5,5'-тетраметилбензидин в цитратно-фосфатном буфере с перекисью водорода) и выдерживали Г5-30 мин при комнатной температуре (18-25°С). При правильной постановке в контроль* ных лунках реакция не развивалась. В опыте появлялось синее окрашивание, интенсивность которого возрастала с увеличением количества выявляемых антител. Реакцию останавливали добавлением 100 мкл 5% раствора H2S04, после чего гранулы магнитосорбента удаляли из лунок. Результаты учитывали на многоканальном микропланшетном спектрофотометре при длине волны 450 нм, полученные значения выражали в единицах оптической плотности, для получения которых от среднего значения измерен ЗФР с 0,05% Твин-20, вносили с помощью многоканальной пипетки по 100 мклI раствора субстрата (3,3',5,5'-тетраметилбензидин в цитратно-фосфатном буфере с перекисью водорода) и выдерживали 20-30 мин при комнатной температуре (18-25°С). Реакцию останавливали добавлением 100 <мкл 5% раствора H2S04, ♦ после чего гранулы магнитосорбента удаляли из лунок. Результаты учитывали на многоканальном микропланшетном спектрофотометре при длине волны 450 нм, полученные значения выражали в единицах оптической плотности. Наличие антител считалось положительным при превышении значений оптической плотности на 2 стандартных отклонения от 1 средних значений контрольной группы. 3.5. Регенерация магнитосорбентов Регенерацию МС с иммобилизированными ферментами проводили путем промывки гранул 0,1М буфером глицин-НС1 (pH 2,0) восемь раз по 20±3 минут. « Впоследствии гранулы МС отмывались ЗФР до нейтральных значений pH и до I исчезновения следов белка при спектрофотометрическом контроле (экстинкция I меньше 0,05 на длине волны 280 нм). Регенерированные препараты могут по1 вторно использоваться для определения специфических антител по вышеописанным методикам. 3.6. Дополнительные иммунологические и общеклинические лабораторные методы исследования С диагностической целью, а также для оценки корреляции с изучаемыми показателями был проведен целый ряд иммунологических проб, позволяющих охарактеризовать иммунный статус больных РА. Методом радиальной иммунодиффузии в геле по Манчини определяли различные классы иммуноглобулинов: A, G, М. Ревматоидный фактор выявляли с помощью теста латекс агглютинации. Циркулирующие иммунные комплексы определяли методом преципитации с полиэтиленгликолем 6000 по Haskova в модификации Б.А.Лемперта. Определение антинуклеарного фактора по Кунсу |