ставляет 1,54 см , следовательно, максимальная теоретическая сорбционная емкость лунки составит 616 нг. В то же время, при использовании ИГАП, площадь поверхности, соприкасающейся с исследуемой сывороткой существенно больше. Приблизительно оценить ее можно по упрощенной модели, приняв ИГАП за идеальную несжимаемую сферу и предположив, что все гранулы имеют абсолютно одинаковый размер. Для гранул, размером .10 мкм (радиус 5 мкм) площадь их поверхности при использовании 100 мкл 50% взвеси гранул составит 30 см , а для гранул размером 100 мкм Л (радиус 50 мкм) 3 см . Учитывая, что размер гранул неодинаков и варьирует в диапазоне от 10 до 100 мкм, можно принять, что взвесь состоит из равного соотношения гранул двух размеров минимального и максимального, в такой моделиплощадь их поверхности в одной пробе составит 16,5 см2, то есть более чем в 10 раз превышает площадь поверхности лунки при традиционном варианте иммуноферментного анализа. При.расчете теоретической сорбционной емкости лунки планшета мы исходили из того, что молекулы,антигена расположены на поверхности в виде плотноI го монослоя. При использовании ИГАП молекулы антигена включаются в трехмерную структуру геля и концентрируются в поверхностном, слое. Однако предположить, что молекулы, антигена находятся на поверхности в виде плотного монослоя нельзя, поэтому при расчете концентрации фермента на поверхности гранул (параметра, смысл которого аналогичен сорбционной емкости планшета) примем, что слой антигена покрывает ХА поверхности гранулы. В таком случае в одной пробе будет доступны для реакции 1,65 мкг антигена. Таким образом, количество антигена при постановке иммуноферментного анализа с использованием ИГАП в 2,68 раза больше, чем при постановке анализа с антигеном, сорбированным на планшетах. При постановке иммуноферментного анализа с использованием ИГАП наблюдаются как повышение аффинности, связанное с разделением фаз и повышением локальной эффективной концентрации связывающих участков антигена на разделе фаз, так и существенное увеличение концентрации антигена при умень |
римой формы ГДА —62,2+4,41 Ед, иммобилизированной —58,6±3,63 Ед). Кроме того, иммобилизация повышает устойчивость ферментов к воздействию высоких температур: после автоклавирования активность растворимых форм изучаемых ферментов рованных незначительно уменьшилась на 6,03 %, для ПНФ уменьшилась на 11,69 %, для ГДА уменьшилась на 9,89 %). 3.4. Оригинальные иммунологические методы исследования Учитывая, что модифицированная методика иммуноферментного анализа с использованием магнитосорбентов имеет очевидные преимущества перед методиками, использующими в качестве твердой фазы полистироловый планшет [13, 57], при проведении исследований, направленных на изучение процессов антителогенеза к ферментам ПМ, предпочтение было отдано ИФА с иммобиллизированными магнитосорбентами. Различия в результатах при использовании различных вариантов ИФА могут быть объяснены с точки зрения свойств адсорбции белка на полистироле* (классический ИФА на полистироловых планшетах) и включения белка в структуру геля (модификация ИФА с использованием МС) и кинетики реакции: образования комплекса антиген-антитело на разделе фаз. При постановке иммуноферментного анализа с использованием MG наблюдается повышение аффинности, связанное с разделением фаз и повышением локальной эффективной концентрации связывающих участков антигена на разделе фаз, а также существенное увеличение концентрации антигена при уменьшении объема реагентов. Кроме того, помещение гранул с магнитными свойствами в переменное магнитное поле вызывает перемещение фаз друг относительно друга, в результате чего вероятность встречи антигенраспознающего центра антител, находящихся в жидкой фазе, с антигеном, фиксированном на твердой фазе, повышается. Также этим достигается перемешивание компонентов системы, предотвращающее неравномерность распределения компонентов в растворе, что в итоге |