|
шении объема реагентов. Кроме того, помещение гранул с магнитными свойствами в переменное магнитное поле вызывает перемещение фаз друг относительно друга, в результате чего вероятность встречи антигенраспознающего центра антител, находящихся в жидкой фазе, с антигеном, фиксированном на твердой фазе, повышается. Также этим достигается перемешивание компонентов системы, предотвращающее неравномерность распределения компонентов в растворе. Таким образом, реакция антиген —антитело смещается в направлении образования комплекса, что и находит свое отражение в полученных данных. Таким образом, учитывая, что модифицированная методика иммуноферментного анализа с использованием ИГАП имеет очевидные преимущества перед ч методиками, использующими в качестве твердой фазы полистироловый планшет [25,118], при проведении исследований, направленных на изучение процессов антителогенеза к ферментам АОС и ПМ, предпочтение было отдано ИФА с иммобиллизированными антигенными препаратами. 4:5; Определение авидности изучаемых антител Для-измерения авидности специфических IgG используются.различные методики агглютинация, радиоиммунныи метод, метод связывания* комплемента, электрофорез, электроблоттинг и иммуноферментный метод. В нашей работе для< определения* показателя индекса авидности (ИА) изучаемых антител был применен иммуноферментный анализ. Суть метода заключается в следующем. При инкубации образцов сыворотки крови с адсорбированными на планшете антигенами образуются иммунные комплексы. После промывания планшета в часть лунок добавляется раствор, который способствует удалению "ранних" IgG, отличающихся низкой авидностью (денатурирующий агент). После внесения конъюгата контролируется его связывание с комплексом антигенантитело с помощью раствора хромогена. Интенсивность окраски пропорциональна количеству антител в образце. После остановки ферментативной реакции измеряют оптическое поглощение окрашенного раствора с помощью’Спектрофотометра. Присутствие в исследуемом образце IgG антител с низкой авидностью |
римой формы ГДА —62,2+4,41 Ед, иммобилизированной —58,6±3,63 Ед). Кроме того, иммобилизация повышает устойчивость ферментов к воздействию высоких температур: после автоклавирования активность растворимых форм изучаемых ферментов рованных незначительно уменьшилась на 6,03 %, для ПНФ уменьшилась на 11,69 %, для ГДА уменьшилась на 9,89 %). 3.4. Оригинальные иммунологические методы исследования Учитывая, что модифицированная методика иммуноферментного анализа с использованием магнитосорбентов имеет очевидные преимущества перед методиками, использующими в качестве твердой фазы полистироловый планшет [13, 57], при проведении исследований, направленных на изучение процессов антителогенеза к ферментам ПМ, предпочтение было отдано ИФА с иммобиллизированными магнитосорбентами. Различия в результатах при использовании различных вариантов ИФА могут быть объяснены с точки зрения свойств адсорбции белка на полистироле* (классический ИФА на полистироловых планшетах) и включения белка в структуру геля (модификация ИФА с использованием МС) и кинетики реакции: образования комплекса антиген-антитело на разделе фаз. При постановке иммуноферментного анализа с использованием MG наблюдается повышение аффинности, связанное с разделением фаз и повышением локальной эффективной концентрации связывающих участков антигена на разделе фаз, а также существенное увеличение концентрации антигена при уменьшении объема реагентов. Кроме того, помещение гранул с магнитными свойствами в переменное магнитное поле вызывает перемещение фаз друг относительно друга, в результате чего вероятность встречи антигенраспознающего центра антител, находящихся в жидкой фазе, с антигеном, фиксированном на твердой фазе, повышается. Также этим достигается перемешивание компонентов системы, предотвращающее неравномерность распределения компонентов в растворе, что в итоге |