|
тем введения в инкубационную среду хлористого никеля, полностью ингибирующего активность 5'-НТ. Вследствие этого в методике в одной пробе определяется общая фосфатазная активность (5 '-НТ и ЩФ), а в другой пробе —только активность ЩФ (активность 5'-НТ ингибирована никелем). Разница между общей фосГ щ фатазной активностью и активностью ЩФ дает значение активности 5 '-НТ. 4.8.7. Определение активности пуриннуклеозидфосфорилазы Активность ПНФ определялась по методике Robertson В.С. и Hoffe Р.А. Принцип метода основан на определении МЕС, образующейся в ходе двухэтапной реакции с внесением в реакционную смесь дополнительного фермента —ксантиноксидазы, которая воздействует на конечный продукт ПНФ-реакции>—ксантин, переводя его в мочевую кислоту [295]. Активность ПНФ рассчитывают по образованию мочевой кислоты, используя формулу: АЕ х 3,0 х 1000 Активность ПНФ = ------------------------мкмоль/л/мин, где 12,6 х 0,1 ДЕ —изменение экстинкции опытного раствора за 1 минуту (в среднем); 3,0 — объем инкубационной смеси (в мл); 1000 —пересчет на 1 литр; 12,6 коэффициент молярной’экстинкции'мочевой?кислоты«при*293 нм; 0,1 —количество сыворотки (в мл). За 1Ед активности ПНФ принимают 1 мкмоль/л/мин. 4.8.8. Определение активности гуаниндезаминазы Для определения активности гуаниндезаминазы использовалась методика Caraway W.T., основаннаяна колориметрическом определении свободногоаммиака, образующегося при дезаминировании гуанина в ксантин, с использованием цветной‘реакции Бертелота [172]. Сыворотка крови может храниться в холодильнике при температуре 1-4°С без потери гуаназной активности в течение 2-х недель. Следы гемолиза не влияют на активность ГДА вследствие отсутствия этогоФ энзима в эритроцитах. |
проводилось методом непрямой иммунофлюоресценции с использованием в качестве субстрата криостатных срезов печени белой крысы в качественном варианте с выделением типа и интенсивности свечения [34]. Общеклинические лабораторные исследования выполнялись по методикам, описанным ранее [34]. У больных проводился общий анализ крови с подсчетом лейкоцитарной формулы, тромбоцитов (по показаниям —ретикулоцитов), общий анализ мочи с количественным определением протеинурии и микроскопическим исследованием. Биохимические анализы включали определение билирубина, аминотрансфераз (аланиновой и аспарагиновой), мочевины и креатинина сыворотки, общего белка крови. По показаниям проводилось исследование коагулограммы. 3.7. Биохимические методы исследования Активность изучаемых ферментов определялась в сыворотке крови, которая забиралась у больных (и здоровых) из локтевой вены утром до приема пищи. Кровь со следами гемолиза не использовалась. Исследование энзиматической активности 5'-НТ, ПНФ и ГДА проводилось в день забора крови. 3.7.1. Определение активности 5'-нуклеотидазы Для определения активности 5'-НТ использовалась методика, предложенная Wood R., Williams D. (1981), основанная на измерении количества неорганического фосфора в результате дефосфорилирования АМФ под влиянием 5'НТ [197]. При использовании АМФ в качестве субстрата его дефосфорилирование происходит не только за счет 5'-НТ, но и неспецифических щелочных фосфатаз (ЩФ), что лишает реакцию специфичности. В данной методике этот недостаток устраняется путем введения в инкубационную среду хлористого никеля, полностью ингибирующего активность 5'-НТ. Вследствие этого в методике в одной пробе определяется общая фосфатазная активность (5'-НТ и ЩФ), а в другой пробе —только активность ЩФ (активность 5'-НТ ингибирована нике * t i P 3.7.2." Определение активности пуриннуклеозидфосфорилазы У 1. . . к V А кти вн о сть ПНФ определялась по методике Robertson B.G' и Hoffe Р.А. ). Принцип метода основан на определении МК, образующейся в ходе ♦ 4 < ' * 4 * * А Л V ч , И , к iv двухэтапной реакции с внесением в реакционную смесь дополнительного фермента —ксантиноксидазы, которая воздействует на конечный продукт ПНФр ч реакции —ксантин, переводя его в мочевую кислоту [172]. у Э, 1 Ф 'Ь \ Г 4 . 1 .1-,' Необходимые реагенты: 1. 0Ю5 М фосфатный буфер, pH 7,5 / ч 2. Рабочий раствор инозина: 5 мг инозина,(фирмы "Reanal", Венгрия) расл творяется в 5 мл дистиллированной воды (если не растворяется, добавить 1 каплю IN NaOH; готовится в день опыта). 3. Ксантиноксидаза (суспензия в 2,3 М (NH^SC^; 8,3 ед/мл, фирмы "Sigma", США): / % ■П) / т i J л I ч :и Й •J' Необходимое оборудование: спектрофотометр е УФ-диапазоном спектра♦ * («Beckman DU-8B»), термостат, центрифуга' до ЗООО об./мин, химическая мерная посуда f Ь V, >,' р I. л ; г ч < • •■•у • . г . ак X I t * л • V . X , ?I * i * . * If Т т й• * ■ ■ * г я'V • ' pH V,!) *л t-j, р 4 s. Л . * * ч ft *3 Ход определения. ч ■ В опытную пробирку последовательно добавить 0,1 мл сыворотки, 2,6 мл 0,05 М фосфатного буфера, 0,06 ед. ксантиноксидазы (соответствуют 8 мкл).* Смешать. Инкубировать в термостате 15 мин при t=37°G. Затем добавить 0,25 ч * мл рабочего раствора инозина и спектрофотометрировать. каждую минуту Э ч опытную пробирку против,контроля при длине волны 293 hm>в течение 10 мин. * *1 I В качестве контроля используется смесь, состоящая из 2,75 мл 0,05 IvLфосфат' ного буфера и 0^25:мл рабочего раствора инозина. ► Активность ПНФ рассчитывают по образованию мочевой кислоты, используя формулу: Активность ПНФ ДЕ х 3,0 х 1000 12,6 х 0,1 МКМОЛЬ/Л/МИН; где ч I ф ♦ I * I * ♦ ' п .*1 л ,1♦ *ф ч ДЕ —изменение экстинкции опытного раствора за 1минуту (в среднем); 3,0 —объем инкубационной смеси (в мл); 1000 —пересчет на 1литр; 12,6 —коэффициент молярной экстинкции мочевой кислоты при 293 нм; 0,1 —количество сыворотки (в мл). За 1Ед активности ПНФ принимают 1 мкмоль/л/мин. 3.7.3. Определение активности гуаниндезаминазы Для определения активности гуаниндезаминазы использовалась методика Caraway W.T., основанная на колориметрическом определении свободного аммиака, образующегося при дезаминировании гуанина в ксантин, с использованием цветной реакции Бертелота [92]. Необходимые реагенты (используется деионизированная вода или дистиллированная после 10 минутного кипячения): 1. 0,05 М фосфатный буфер, pH 7,5. 2. 10 % раствор вольфрамовокислого Na (10 г вольфрамовокислого Na растворяют при осторожном нагревании в 90 мл дистиллированной воды и доводится до 100 мл). 3. Цветной феноловый реагент (125 мг нитропруссида Na и 25 мл жидкого 88% фенола растворить при нагревании в водяной бане в 500 мл дистиллированной воды; раствор хранится в темной посуде до 4 месяцев). 4. Щелочной гипохлорит (12,5 г NaOH и 20 мл гипохлорита Na растворить в 500 мл дистиллированной воды; раствор хранится в темной посуде до 6 месяцев). 5. 2/3NH2S04. 6. Основной стандарт, 2 мг N/мл (0,9434 г сухого сульфата аммония растворить в 100 мл 0,IN H2SO4). 7. Рабочий стандарт, 8 мкг N/мл (1,0 мл основного стандарта развести дистиллированной водой до 250 мл). |