|
Для блокирования эндогенной пероксидазы срезы инкубировали 20 минут в темноте с 3% перекисью водорода, приготовленной на дистиллированной воде, а затем промывали 5 минут в фосфатном буфере. Для блокирования неспсцифического связывания антител срезы инкубировали 15 минут с 1% раствором бычьего сывороточного альбумина. Инкубацию с первичными антителами проводилипри 4°С в течение 12 часов. После первичных антител стекла промывали 2 раза по 5 минут в фосфатном буфере. Инкубация со вторыми антителами [ЬЗАВ^+кк, ОАК.О] проводили при комнатной температуре в течение 20 минут, и затем срезы промывали 2 раза по 5 минут. Инкубация с антителами, меченными стрептавидином, [Ь8АВ0+кй, ОАКО] проводили при комнатной температуре в течение 20 минут, и затем срезы промывали 3 раза по 5 минут. Для визуализации иммуногистохимической реакции использовали ИАВ+ систему [ОАКО]. Реакцию проводили в темноте в течение 5-10 минут. Срезы докрашивали гематоксилином Майера и заключали в канадский бальзам. Таблица 15 Антитела, использованные в работе 52 Антитела Разведение Примечание Анти-р53 1:200 Нсмелкоклеточный рак Анти-Вс1-2 1:50 Немелкоклеточный рак Анги-Вах 1:500 Немелкоклеточный рак Анти-УЕСР 1:500 Немелкоклеточный рак Оценку результатов окрашивания проводили с применением светового микроскопа «Ьс1са» (Германия) под увеличением х 10, х20, х40. Для всех маркеров оценивали локализацию окрашивания в клетке (ядро, цитоплазма, мембрана). Количество положительных клеток оценивали в зонах, содержащих их максимальное количество. В исследовании применяли следующие критерии оценки маркеров: опухоль считали отрицательной но р53, если в ткани опухоли отсутствовала ядерная реактивность с антителами или количество окрашенных |
2.2. Методы исследования 2.2.1. Иммуногистохимический метод Иммуногистохимический анализ проводили на парафиновых блоках опухолей, полученных при рутинной патологоанатомической работе. Использованные в работе первичные антитела и их разведения представлены в таблице 3. Парафиновые срезы депарафинировали и регидратировали по стандартной методике. Для "демаскировки" антигенов проводили прогревание срезов на водяной бане в предварительно нагретом до 95-99°С нитратном буфере в течение 30 минут. Затем стекла охлаждали при комнатной температуре в течение 15-20 минут, и переносили в фосфатный буфер на 5 минут. Для блокирования эндогенной пероксидазы срезы инкубировали 20 минут в темноте с 3% перекисью водорода, приготовленной на дистиллированной воде, а затем промывали 5 минут в фосфатном буфере. Для блокирования неспецифического связывания антител срезы инкубировали 15 минут с 1% раствором бычьего сывороточного альбумина. Инкубацию с первичными антителами проводили при 4° С в течение 12 часов. После первичных антител стекла промывали 2 раза по 5 минут в фосфатном буфере. Инкубация со вторыми антителами [Ь8АВ0+кй, ПАКО] проводили при комнатной температуре в течение 20 минут, и затем срезы промывали 2 раза по 5 минут. Инкубация с антителами, меченными стрептавидином, [Ь8АВ0+кк, ИАКО] проводили при комнатной температуре в течение 20 минут, и затем срезы промывали 3 раза по 5 минут. Для визуализации иммуногистохимической реакции использовали ПАВ+ систему [ОАКО]. Реакцию проводили в темноте в течение 5-10 минут. Срезы докрашивали гематоксилином Майера и заключали в канадский бальзам. 58 Антитела, использованные в работе Таблица 8 Антитела Разведение Примечание 1. Анти-р53 1:200 Плоскоклеточный рак 2. Анти-Вс1-2 1:50 Плоскоклеточный рак 3. Анти-Вах 1:500 Плоскоклеточный рак 4. Анти-УЕСР 1:500 Плоскоклеточный рак Оценку результатов окрашивания проводили с применением светового микроскопа «Ьегса» (Германия) под увеличением х10, х20, х40. Для всех маркеров оценивали локализацию окрашивания в клетке (ядро, цитоплазма, мембрана). Количество положительных клеток оценивали в зонах, содержащих их максимальное количество. В исследовании применяли следующие критерии оценки маркеров: опухоль считали отрицательной по р53, если в ткани опухоли отсутствовала ядерная реактивность с антителами или количество окрашенных клеток было менее 25%; и положительной по р53, если было окрашено более 25% ядер опухолевых клеток; опухоль считали отрицательной по Вс1-2 или Вах, если в ткани опухоли отсутствовала цитоплазматическая реактивность с антителами или количество окрашенных клеток было менее 25%; и положительной по Вс1-2 или Вах, если было окрашено более 25% опухолевых клеток. Количество сосудов, окрашиваемых антителами к УБОР, оценивали полу количественно по градациям: 1 отсутствие окрашивания; 2окрашивание небольшого числа сосудов; 3 окрашивания среднего числа сосудов в опухоли и 4 в опухоли наблюдается окрашивание большого числа сосудов. 59 |