|
клеток быломенее 25%; и положительной по р53, если было окрашено более 25% ядер опухолевых клеток; опухоль считали отрицательной по Вс1-2 или Вах, если в ткани опухоли отсутствовала цитоплазматическая реактивность с антителами или количество окрашенных клеток было менее 25%; и положительной по Вс1-2 или Вах, если было окрашено более 25% опухолевых клеток. Количество сосудов, окрашиваемых антителами к УЕСК, оценивали полуколичеетвеино по'градациям: 1 отсутствие окрашивании; 2окрашивание небольшого »ч и ела сосудов; 3 окрашивания среднего числа сосудов в опухоли и 4 — в опухоли наблюдается окрашивание большого числа сосудов. 2.2.2. Методика определения содержания ДНК методом лазерной проточной цитофлуорометрии при немелкоклеточном рак легкого При использовании материала из парафиновых блоков на микротоме изготавливалось по 3-5 среза по 50 мкм с каждого блока. Срезы депарафипировали в трех порциях смеси ксилола с гексаном в пропорции 1:1. Затем осуществляли регидратацию в спиртах нисходящей концентрации. После регидратации тканевые фрагменты дезагрегировали с помощью 0,5% раствора пепсина (активность 2500 Ед/мг) при рН 1,5 и температуре 37° в течение 45 минут при постоянном встряхивании. После центрифугирования осадок ресуспензировали в 3 мл ТРИС-буфера рН 7,4 с 3600 иш($/мл РНКазы ($1§та, США). Перед исследованием отсасывали надосадочиую жидкость, отбирали 1 каплю осадка (остальную часть заливали 70 % этанолом и хранили для повторных исследований) и окрашивали специфичным для ДНК красителем: РгорЮшт юсНбе (50 мг/л, ТРИС-буфер рН 7,4 «81&та») и фильтровали через 70 мкм нейлоновый фильтр. Образцы исследовались на проточном анализаторе ЕР1СЗ-ХЬ (СоиКегВесктеп, США) с аргоновым лазером. Флуоресценцию окрашенных ядер, в голубой области спектра (88 нм) улавливали фотоумножители анализатора, преобразуя ее затем в электрические сигналы, на основании которых прибор |
Антитела, использованные в работе Таблица 8 Антитела Разведение Примечание 1. Анти-р53 1:200 Плоскоклеточный рак 2. Анти-Вс1-2 1:50 Плоскоклеточный рак 3. Анти-Вах 1:500 Плоскоклеточный рак 4. Анти-УЕСР 1:500 Плоскоклеточный рак Оценку результатов окрашивания проводили с применением светового микроскопа «Ьегса» (Германия) под увеличением х10, х20, х40. Для всех маркеров оценивали локализацию окрашивания в клетке (ядро, цитоплазма, мембрана). Количество положительных клеток оценивали в зонах, содержащих их максимальное количество. В исследовании применяли следующие критерии оценки маркеров: опухоль считали отрицательной по р53, если в ткани опухоли отсутствовала ядерная реактивность с антителами или количество окрашенных клеток было менее 25%; и положительной по р53, если было окрашено более 25% ядер опухолевых клеток; опухоль считали отрицательной по Вс1-2 или Вах, если в ткани опухоли отсутствовала цитоплазматическая реактивность с антителами или количество окрашенных клеток было менее 25%; и положительной по Вс1-2 или Вах, если было окрашено более 25% опухолевых клеток. Количество сосудов, окрашиваемых антителами к УБОР, оценивали полу количественно по градациям: 1 отсутствие окрашивания; 2окрашивание небольшого числа сосудов; 3 окрашивания среднего числа сосудов в опухоли и 4 в опухоли наблюдается окрашивание большого числа сосудов. 59 2.2.2. Методика определения содержания ДНК методом лазерной проточной цитофлуорометрии при плоскоклеточном раке легкого При использовании материала из парафиновых блоков на микротоме изготавливалось по 3-5 среза по 50 мкм с каждого блока. Срезы депарафинировали в трех порциях смеси ксилола с гексаном в пропорции 1:1. Затем осуществляли регидратацию в спиртах нисходящей концентрации. После регидратации тканевые фрагменты дезагрегировали с помощью 0,5% раствора пепсина (активность 2500 Ед/мг) при рН 1,5 и температуре 37е в течение 45 минут при постоянном встряхивании. После центрифугирования осадок ресуспензировали в 3 мл ТРИС-буфера рН 7,4 с 3600 ипйз/мл РНКазы ($1§та, США). Перед исследованием отсасывали надосадочную жидкость, отбирали 1 каплю осадка (остальную часть заливали 70 % этанолом и хранили для повторных исследований) и окрашивали специфичным для ДНК красителем: РгорЫшт юсйбе (50 мг/л, ТРИС-буфер рН 7,4 «$1&та») и фильтровали через 70 мкм нейлоновый фильтр. Образцы исследовались на проточном анализаторе ЕР1СЗ-ХЬ (Соийег-Вескшеп, США) с аргоновым лазером. Флуоресценцию окрашенных ядер, в голубой области спектра (88 нм) улавливали фотоумножители анализатора, преобразуя ее затем в электрические сигналы, на основании которых прибор строил ДНК гистограмму. В каждом образце анализировались не менее 25000 клеток при строгом цитологическом контроле. С помощью встроенной в прибор ЭВМ полученные данные записывались на дискеты и анализировались соответствующими компьютерными программами: Зуз1ет-И1Ь (уегзюп 3,0 Соийег, США) и \УтЫ$1: и МиШСус1е (РЬоетх Р1оуу 8у$1ешз, США). Данное програмное обеспечение позволяет отделить целые клетки опухоли от разрушенных, убрать фрагменты опухолевой ткани, конгломераты клеток опухоли и автоматически 60 |