строил ДНК гистограмму. В каждом образце анализировались не менее 25000 клеток при строгом цитологическом контроле. С помощью встроенной в прибор ЭВМ полученные данные записывались на дискеты и анализировались соответствующими компьютерными программами: Зу51ет-ИгЬ (уегзюп 3,0 СоиКег, США) и №пЫ& и МиШСус1е (РЬоешх Р!о\у 8уз1ст$, США). Данное программное обеспечение позволяет отделить целые клетки опухоли от разрушенных, убрать фрагменты опухолевой ткани, конгломераты клеток опухоли и автоматически рассчитать индекс ДНК (И-ДНК), процент аиеуплоидных клеток в опухоли, их число в 00/1, 8, и 02+М фазах клеточного цикла, при цитологическом контроле с помощью методики Су1о$рш (ЗЬашЗоп, Великобритания). В полученной гистограмме процент клеточных ядер с различным содержанием ДНК вычислялся по отношению к общему числу исследованных клеток. Коэффициент вариации был меньше 10%. В качестве диплоидного стандарта использовали лимфоциты человека. Для характеристики степени анеуплоидии использовали И-ДНК, который характеризует соотношение интенсивности флуоресценции пика анеуплоидных клеток к пику диплоидных. И-ДНК диплоидных клеток соответствует 1,0; И-ДНК тетраплоидных был равен 2,0; анеуплоидиых более или менее 1,0. 2.2.3. Математический обработка материала При оценке отдаленных результатов хирургического лечения исследовалась кумулятивная выживаемость по методу Кар1ап-Ме1ег с использованием компьютерной программы 31айз11с 5.5. Оценка достоверности различий в выборках проводилась по критерию Фишера. 54 |
2.2.2. Методика определения содержания ДНК методом лазерной проточной цитофлуорометрии при плоскоклеточном раке легкого При использовании материала из парафиновых блоков на микротоме изготавливалось по 3-5 среза по 50 мкм с каждого блока. Срезы депарафинировали в трех порциях смеси ксилола с гексаном в пропорции 1:1. Затем осуществляли регидратацию в спиртах нисходящей концентрации. После регидратации тканевые фрагменты дезагрегировали с помощью 0,5% раствора пепсина (активность 2500 Ед/мг) при рН 1,5 и температуре 37е в течение 45 минут при постоянном встряхивании. После центрифугирования осадок ресуспензировали в 3 мл ТРИС-буфера рН 7,4 с 3600 ипйз/мл РНКазы ($1§та, США). Перед исследованием отсасывали надосадочную жидкость, отбирали 1 каплю осадка (остальную часть заливали 70 % этанолом и хранили для повторных исследований) и окрашивали специфичным для ДНК красителем: РгорЫшт юсйбе (50 мг/л, ТРИС-буфер рН 7,4 «$1&та») и фильтровали через 70 мкм нейлоновый фильтр. Образцы исследовались на проточном анализаторе ЕР1СЗ-ХЬ (Соийег-Вескшеп, США) с аргоновым лазером. Флуоресценцию окрашенных ядер, в голубой области спектра (88 нм) улавливали фотоумножители анализатора, преобразуя ее затем в электрические сигналы, на основании которых прибор строил ДНК гистограмму. В каждом образце анализировались не менее 25000 клеток при строгом цитологическом контроле. С помощью встроенной в прибор ЭВМ полученные данные записывались на дискеты и анализировались соответствующими компьютерными программами: Зуз1ет-И1Ь (уегзюп 3,0 Соийег, США) и \УтЫ$1: и МиШСус1е (РЬоетх Р1оуу 8у$1ешз, США). Данное програмное обеспечение позволяет отделить целые клетки опухоли от разрушенных, убрать фрагменты опухолевой ткани, конгломераты клеток опухоли и автоматически 60 рассчитать индекс ДНК (И-ДНК), процент анеуплоидных клеток в опухоли, их число в 00/1, 8, и 02+М фазах клеточного цикла, при цитологическом контроле с помощью методики СуЮзрт (8Ьапс1оп, Великобритания). В полученной гистограмме процент клеточных ядер с различным содержанием ДНК вычислялся по отношению к общему числу исследованных клеток. Коэффициент вариации был меньше 10%. В качестве диплоидного стандарта использовали лимфоциты человека. Для характеристики степени анеуплоидни использовали ИДНК, который характеризует соотношение интенсивности флуоресценции пика анеуплоидных клеток к пику диплоидных. И-ДНК диплоидных клеток соответствует 1,0; И-ДНК тетраплоидных был равен 2,0; анеуплоидных-более или менее 1,0. 2.2.3. Математический аппарат факторного анализа системы «ФАКТОР» При анализе клинического материала была использована новая технология компьютерной обработки информации система регрессионно-факторного анализа многопараметрических объектов, разработанная главным специалистом по системам научного анализа Колосовым Е.А. и зарекомендовавшая себя при решении научных задач прогноза и оптимизации лечения в онкологии у взрослых и детей в ряде предыдущих исследований [31, 34, 35, 43]. Метод получил положительную оценку специалистов по компьютерной обработке данных в научно-практической работе на научной сессии МИФИ 2001 года с международным участием, и подтверждена возможность решения с его помощью научно-практических задач оценки эффективности, точного прогнозирования и оптимального 61 сти мы приводим статистически значимые зависимости, полученные в результате обработки данных стандартными статистическими методами. При оценке отдаленных результатов хирургического лечения исследовалась кумулятивная выживаемость по методу Кар1ап-Ме1ег с использованием компьютерной программы 3(а(1$11С 5.5. Оценка достоверности различий в выборках проводилась по критерию Фишера. 66 |