|
54 Одновременно осуществлялся забор крови из локтевой вены для определения ТБГ и ХГЧ в сыворотке. Обе биопробы: хориальную ткань и сыворотку крови (СК) замораживали в отдельных пробирках при температуре -40°С. Остаток соскоба фиксировали в 10% растворе нейтрального формалина. В лаборатории клеточной иммунопатологии и биотехнологии НИИ морфологии человека (рук. д.б.н. М.Н.Болтовская) все биопробы размораживали. Ткань хориона подсушивали на фильтровальной бумаге, взвешивали и готовили гомогенат ворсин (ТВ). Для количественной оценки ТБГ и ХГЧ в СК, ГЭ и смывах из полости матки использовали твердофазный иммуноферментный анализ (ИФА), «сэндвич»-вариант, на основе моноклональных антител. Технология метода: 96-луночные планшеты («Costar») сенсибилизировали моноклональными антителами (МАТ) против АМГФ и ПАМГ (10мкг/мл) на карбонат бикарбонатном буфере pH 9,5. В лунки вносили по 100 мкг стандарта антигена в разведениях (от 100 до 0.7 нг/мл)и тестируемые жидкости, инкубировали в течение 1 ч при 37°С и затем добавляли по 100 мкл вторых МАТ с пероксидазой в разведении 1:1000. После инкубации при 37°С в течение 1 ч вносили 0.4% раствор офенилендиамина в цитрат фосфатном буфере pH 4,7 с 0,1% перекиси водорода. Через 20 мин реакцию останавливали 50% серной кислотой. Результаты учитывали на «Multiskan Titertek, Flow». Патоморфологические исследования Материал соскоба из полости матки пациенток 1 группы после неразвивающейся беременности и у женщин П группы после медицинского аборта фиксировался в растворе нейтрального формалина. Его гистологический анализ проводился в лаборатории патологической |
50 Иммуноферментный метод. В соответствии с задачами, поставленными в настоящей работе, проведены исследования, позволяющие определить морфофункциональное состояние эндометрия при неразвивающейся беременности. При выскабливании стенок полости матки у пациенток обеих групп вначале удаляли плодное яйцо, затем в отдельную емкость собирали материал последующего соскоба эндометрия. Весь материал промывали проточной водой, потом физиологическим забуферным раствором для освобождения от остатков материнской крови. Одновременно осуществлялся забор крови из локтевой вены для определения эндометриальных белков в сыворотке. Обе биопробы: эндометрий и сыворотку крови (СК) замораживали в отдельных пробирках при температуре -40°С. Остаток соскоба фиксировали в 10% растворе нейтрального формалина. Кроме того, после лечения, проведенного пациенткам с неразвивающейся беременностью, проводилось контрольное определение эндометриальных белков АМГФ И ПАМГ в смыве из полости матки. Исследования проводились на 22-24 дни цикла, которые соответствуют пику расцвета желтого тела в яичнике, максимальной продукции прогестерона и максимальной секреции эндометриальных желез в эндометрии. Отбор смывов из полости матки осуществлялся путем введения физиологического раствора в полость матки в количестве 2 мл при помощи аспирационной кюретки —пайпель. Полученный материл также подвергался заморозке. В лаборатории клеточной иммунопатологии и биотехнологии НИИ морфологии человека (рук. д.б.н. М.Н.Болтовская) все биопробы размораживали. Ткань эндометрия подсушивали на фильтровальной бумаге, взвешивали и готовили гомогенат эндометрия (ГЭ). Для количественной оценки АМГФ и ПАМГ в СК, ГЭ и смывах из полости матки использовали твердофазный иммуноферментный анализ (ИФА), «сэндвич»-вариант, на основе моноклональных антител. Технология метода: 96-луночные планшеты («Costar») сенсибилизировали моноклональными антителами (МАТ) против АМГФ и ПАМГ (10мкг/мл) на карбонат бикарбонатном буфере pH 9,5. В лунки вносили по 100 мкг стандарта антигена в разведениях (от 100 до 0.7 нг/мл)и тестируемые жидкости, инкубировали в течение 1 ч при 37°С и затем добавляли по 100 мкл вторых МАТ с пероксидазой в разведении 1:1000. После инкубации при 37°С в течение 1 ч вносили 0.4% раствор офенилендиамина в цитрат — фосфатном буфере pH 4,7 с 0,1% перекиси водорода. Через 20 мин реакцию останавливали 50% серной кислотой. Результаты учитывали на «Multiskan Titertek, Flow». П атоморфологнческие исследования Материал соскоба из полости матки пациенток I группы после неразвивающейся беременности и у женщин II группы после медицинского аборта фиксировался в растворе нейтрального формалина. Его гистологический анализ проводился в лаборатории патологической анатомии болезней детского возраста НИИ морфологии человека (рук. член-корр. РАЕН, профессор А.П.Милованов). Кусочки тканей заливались в парафиновые блоки, готовили микротомные срезы толщиной 5-7 мкм, которые после стандартных гистологических проводок окрашивались гематоксилином и эозином, а также пикрофуксином по Ван Гизону. При просмотре микропрепаратов выявлялись изменения в пределах эндометрия, в пограничных слоях миометрия, а также в плаценте или хориальной ткани. Пациенткам I группы после лечения с целью определения его эффективности проводилось гистологическое исследование биоптатов эндометрия, полученных с помощью аспирационной кюретки “пайпель”. |