наиболее обоснованным определение именно уровня СРБ и частоты его повышенных значении. Всем лицам, включенным в исследование, определение СРБ высокочувствительным методом проводилось в отделе неирогуморальных иммунологических исследований РКНПК Росмедтехнологий под руководством профессора Масенко В.П., нефелометрическим методом с помощью диагностических наборов N High Sensitivity CRP, фирмы -Dade Behring, США, на анализаторе BN ProSpec производства Dade Behring. Чувствительность метода равна 0,175 мг/л для измерений выполненных с использованием образцов разведенных 1:20. Коэффициент вариабельности 7,6% [290]. Согласно международным рекомендациям [291] сыворотки с содержанием СРБ более 3,0 мг/л рассматривались как СРБ-положительные. П.2.2. Методика определения аутоантител к Pi-адренорецепторам Среди кардиоспецифических маркеров аутоиммунных процессов У больных с нарушениями ритма сердца аутоантитела к Pi-АР представляют особый интерес поскольку доказано, что они являются агонистами Pi-АР, т.е. обладают катехоламиноподобными эффектами, вызывая стимуляцию рецепторов in vitro и тем самым могут создавать условия для развития аритмий. [98,99, 294]. Аутоантитела к pjAP в сыворотке крови больных всех трех групп и лиц контрольной группы определялись методом прямого иммуноферментного анализа с использованием в качестве антигена синтетического фрагмента, содержащего 26 аминокислот второй петли PiАР (197 [42, 47, 66]. Оптическую плотность исследуемого образца измеряли на многоканальном спектрофотометре при длине волны 492 нм. За границу нормы было принято среднее арифметическое значение + 2 стандартных отклонения (M+2SD) оптических плотностей, полученных в группе здоровых доноров (п=20). Исследование проводилось в лаборатории ксенотрансплантации, руководимой |
Согласно международным рекомендациям верхняя граница нормы ИЛ-6 в сыворотке крови составила 9,0 пг/мл [Pearson Т. 2003]. П.2.3. Методика определения аутоантител к Pi-адренорецспторам. Определение аутоантител к Pi-АР в сыворотке крови проводилось в лаборатории ксенотрансплантации НИИТ и ИО М3 РФ (руководитель —д.м.н., проф. Тоневицкий А.Г.) методом прямого иммуноферментного анализа с использованием в качестве антигена синтетического фрагмента, содержащего 26 аминокислот второй петли Pi-AP (197 222). Принцип исследования: Раствор пептида в 0.04 М карбонатном буфере (рН=9,6) с концентрацией 1мкг/мл вносили по 100 мкл в лунки поливинилхлоридных планшетов для ИФА (“Titertek”, Шотландия) и выдерживали в течение 18 часов при 4°С. Для блокирования неспецифических снятого молока в фосфатно-солевом буфере который вносили по 100 мкл в лунки планшета и выдерживали в течение 30 мин при 37°С. Исследуемые образцы разводили 3%-ым раствором снятого молока в ФСБ (при необходимости добавлялся “Tween-20” до концентрации 0,05% —ФСБ-Т), вносили в лунки о по 100 мкл и выдерживали на планшете в течение 1,5 —2 часов при 37 С. Планшет промывали 3 раза ФСБ-Т. Затем в лунки вносили по 0,1 мл кроличьих антител, меченных пероксидазой, против IgG человека в разведении (1:1000) в ФСБ-Т и инкубировали 45 мин опри 37 С. Далее планшет отмывали ФСБ-Т 3 раза, после чего в лунки вносили субстратный раствор (0,05% ортофенилендиамин и 0,01% перекись водорода в 0,1М цитратно-фосфатном буфере; рН=4,7). После появления, в результате действия пероксидазы на субстрат, желтой окраски, реакцию останавливали добавлением в лунки 50% раствора серной кислоты и немедленно производили измерение О.П. при длине волны 495 нм. За границу нормы было принято среднее арифметическое значение + 2 стандартных отклонения (M+2SD) О.П., полученных в группе здоровых доноров (п=20). Исследуемые сыворотки хранили при температуре -70°С. |