45 Уровень метаболитов NO (го есть суммарную концентрацию нитратов и нитритов, NOv) определяли колориметрическим методом по развитию окраски в реакции диазотирования нитритом сульфаниламида, входящего в состав реактива Грисса. Для построения калибровочной кривой использовали 1М раствор NaNOo в воде, который хранили при температуре -20°С; перед употреблением его разводили в 1000 раз и готовили серию разведений для построения кривой. Уровень экспрессии эндотелиальной синтазы оксида азота (e-NOS) определяли в клеточном лизате по методу R.J. Hendrickson [111] с небольшими модификациями. По окончании инкубации клеток с исследуемой сывороткой человека их трижды промывали 5 мМ фосфатным буфером, pH 7,4, клетки из одной лунки собирали в 100 мкл лизирующею буфера: 0,1 М ацетат Na, pH 6,8, содержащего 5 мМ ЭДТА и 3% додецилсульфат Na (SDS), центрифугировали 10 мин при 1000 х g и подвергали электрофорезу в полиакриламидном геле (ПААТ) в присутствии SDS, согласно методу [111]. В лунку наносили 20 мкг белка. На каждую пластину наносили смесь предварительно окрашенных белков-метчиков с диапазоном молекулярной массой (М.м.) 7000-200000 Да (Bio-Rad Kaleidoscope Preslained Standards, USA), что позволяло идентифицировать полосу, соответствующую eNOS (М.м. которой 140000 Да). Белок в клеточном лизате определяли по методу Lowry с использованием БСА в качестве стандарта. По окончании электрофореза осуществляли перенос белков с геля на нитроцеллюлозную мембрану Вестерн-блог (60 В, 1 час). Эффективность переноса определяли с помощью обратимого окрашивания мембран белковым красителем Ponceau Red (Sigma, USA). После трёхкратной отмывки мембраны 5 мМ фосфатным буфером, pH 7,4, содержащим 150 мМ NaCl и 0,05% твина-200, её в течение ночи обрабатывали раствором поликлональных кроличьих антител против eNOS человека (BD Transduction |
ления раствора хлористого ванадия 400 мг VCI3 растворяли в 50 мл IN HCI с последующим фильтрованием через бумажный фильтр. Всегда использовали свежеприготовленный раствор. Уровень метаболитов N0 (то есть суммарную концентрацию нитратов и нитритов, NOx) определяли колориметрическим методом по развитию окраски в реакции диазотирования нитритом сульфаниламида, входящего в состав реактива Грисса. Для построения калибровочной кривой использовали 1М раствор NaNCb в воде, который хранили при температуре -20°С; перед употреблением его разводили в 1000 раз и готовили серию разведений для построения кривой. Уровень экспрессии эндотелиальной синтазы оксида азота (e-NOS) определяли в клеточном лизате по методу R.J. Hendrickson [112] с небольшими модификациями. По окончании инкубации клеток с исследуемой сывороткой человека их трижды промывали 5 мМ фосфатным буфером, pH 7,4, клетки из одной лунки собирали в 100 мкл лизирующего буфера: 0,1 М ацетат Na, pH 6,8, содержащего 5 мМ ЭДТА и 3% додецилсульфат Na (SDS), центрифугировали 10 мин при 1000 х g и подвергали электрофорезу в полиакриламидном геле (ПААГ) в присутствии SDS, согласно методу [112]. В лунку наносили 20 мкг белка. На каждую пластину наносили смесь предварительно окрашенных белков-метчиков с диапазоном молекулярной массой (М.м.) 7000-200000 Да (Bio-Rad Kaleidoscope Prestained Standards, USA), что позволяло идентифицировать полосу, соответствующую eNOS (М.м. которой 140000 Да). Белок в клеточном лизате опредляли по методу Lowry с использованием БСА в качестве стандарта. По окончании электофореза осуществляли перенос белков с геля на нитроцеллюлозную мембрану Вестерн-блот (60 В, 1 час). Эффективность переноса определяли с помощью обратимого окрашивания мембран белковым красителем Ponceau Red (Sigma, USA). После трёхкратной отмывки мембраны 5 мМ фосфатным буфером, pi I 7,4, содержащим 150 мМ NaCl и 0,05% твина-200, её в течение ночи обрабатывали раствором поликлональ30 |