Проверяемый текст
Лазаренко Галина Степановна. Исследование эндотелиопротективного эффекта L-аргинина и его комбинаций с эналаприлом и лозартаном (Диссертация 2006)
[стр. 45]

45 Уровень метаболитов NO (го есть суммарную концентрацию нитратов и нитритов, NOv) определяли колориметрическим методом по развитию окраски в реакции диазотирования нитритом сульфаниламида, входящего в состав реактива Грисса.
Для построения калибровочной кривой использовали 1М раствор
NaNOo в воде, который хранили при температуре -20°С; перед употреблением его разводили в 1000 раз и готовили серию разведений для построения кривой.
Уровень экспрессии эндотелиальной синтазы оксида азота (e-NOS) определяли в клеточном лизате по методу R.J.
Hendrickson
[111] с небольшими модификациями.
По окончании инкубации клеток с исследуемой сывороткой человека их трижды промывали 5 мМ фосфатным буфером, pH 7,4, клетки из одной лунки собирали в 100 мкл
лизирующею буфера: 0,1 М ацетат Na, pH 6,8, содержащего 5 мМ ЭДТА и 3% додецилсульфат Na (SDS), центрифугировали 10 мин при 1000 х g и подвергали электрофорезу в полиакриламидном геле (ПААТ) в присутствии SDS, согласно методу [111].
В лунку наносили 20 мкг белка.
На каждую пластину наносили смесь предварительно окрашенных белков-метчиков с диапазоном молекулярной массой (М.м.) 7000-200000 Да (Bio-Rad Kaleidoscope
Preslained Standards, USA), что позволяло идентифицировать полосу, соответствующую eNOS (М.м.
которой 140000 Да).
Белок в клеточном лизате
определяли по методу Lowry с использованием БСА в качестве стандарта.
По окончании
электрофореза осуществляли перенос белков с геля на нитроцеллюлозную мембрану Вестерн-блог (60 В, 1 час).
Эффективность переноса определяли с помощью обратимого окрашивания мембран белковым красителем Ponceau Red (Sigma, USA).
После трёхкратной отмывки мембраны 5 мМ фосфатным буфером,
pH 7,4, содержащим 150 мМ NaCl и 0,05% твина-200, её в течение ночи обрабатывали раствором поликлональных кроличьих антител против eNOS человека (BD Transduction
[стр. 30]

ления раствора хлористого ванадия 400 мг VCI3 растворяли в 50 мл IN HCI с последующим фильтрованием через бумажный фильтр.
Всегда использовали свежеприготовленный раствор.
Уровень метаболитов N0 (то есть суммарную концентрацию нитратов и нитритов, NOx) определяли колориметрическим методом по развитию окраски в реакции диазотирования нитритом сульфаниламида, входящего в состав реактива Грисса.
Для построения калибровочной кривой использовали 1М раствор
NaNCb в воде, который хранили при температуре -20°С; перед употреблением его разводили в 1000 раз и готовили серию разведений для построения кривой.
Уровень экспрессии эндотелиальной синтазы оксида азота (e-NOS) определяли в клеточном лизате по методу R.J.
Hendrickson
[112] с небольшими модификациями.
По окончании инкубации клеток с исследуемой сывороткой человека их трижды промывали 5 мМ фосфатным буфером, pH 7,4, клетки из одной лунки собирали в 100 мкл
лизирующего буфера: 0,1 М ацетат Na, pH 6,8, содержащего 5 мМ ЭДТА и 3% додецилсульфат Na (SDS), центрифугировали 10 мин при 1000 х g и подвергали электрофорезу в полиакриламидном геле (ПААГ) в присутствии SDS, согласно методу [112].
В лунку наносили 20 мкг белка.
На каждую пластину наносили смесь предварительно окрашенных белков-метчиков с диапазоном молекулярной массой (М.м.) 7000-200000 Да (Bio-Rad Kaleidoscope
Prestained Standards, USA), что позволяло идентифицировать полосу, соответствующую eNOS (М.м.
которой 140000 Да).
Белок в клеточном лизате
опредляли по методу Lowry с использованием БСА в качестве стандарта.
По окончании
электофореза осуществляли перенос белков с геля на нитроцеллюлозную мембрану Вестерн-блот (60 В, 1 час).
Эффективность переноса определяли с помощью обратимого окрашивания мембран белковым красителем Ponceau Red (Sigma, USA).
После трёхкратной отмывки мембраны 5 мМ фосфатным буфером,
pi I 7,4, содержащим 150 мМ NaCl и 0,05% твина-200, её в течение ночи обрабатывали раствором поликлональ30

[Back]