|
46 Labs, USA), разведённых (в соотношении 1:500) в 5 мМ фосфатном буфере, pH 7,4, содержащем 0,1% азида натрия. Затем мембрану отмывали 7 раз по 10 мин в том же буфере. В течение часа мембрану инкубировали с разведёнными в соотношении 1:300 вторыми антителами, конъюгированными с пероксидазой хрена (goat anti-rabbit IgG antibodies, Sigma, USA). При этом неспецифическое связывание конъюгатом блокировали добавлением в буфер 5% обезжиренного сухого молока. Затем мембрану снова отмывали в фосфатном буфере (7 раз но 10 мин). Детекцию полосы eNOS проводили методом усиленной хемилюминесценции (ECL). После отмывки в фосфатном буфере 7 раз по 10 мин мембрану обрабатывали соответствующим раствором (BCL, Amersham), как указано производителем, экспонировали на плёнку Hvperfilm-ECL (Amersham UK) в течение 2 ч в темноте. Полоску, соответствующую e-NOS детектировали в соответствии с её молекулярной массой, устанавливаемой по сравнению с белками-метчиками. Плёнку высушивали на воздухе, полосы сканировали и рассчитывали площадь под кривой с использованием программы Total Lab. (рис. 2.1) , * , . "U. Л., • • eNOS, 140 kDa+ + + . . . ± ± Рисунок 2.1. Типичная авторадиограмма Вестерн-блота, окрашенного поликлональными антителами против eNOS с последующей обработкой по методу ECL после его экспонирования с рентгеновской плёнкой «Hyperfilm» (Amersham). 2.4. Морфологические методы оценки сердечно-сосудистых изменений при моделировании L-NAME-нндуцнрованиой ЭД2 Для морфологического подтверждения развития моделируемых патологических процессов и r комплексной оценке эффективности |
ных кроличьих антител против eNOS человека (BD Transduction Labs, USA), разведённых (в соотношении 1:500) в 5 мМ фосфатном буфере, pH 7,4, содержащем 0,1% азида натрия. Затем мембрану отмывали 7 раз по 10 мин в том же буфере. В течение часа мембрану инкубировали с разведёнными в соотношении 1:300 вторыми антителами, конъюгированными с нероксидазой хрена (goat anti-rabbit IgG antibodies, Sigma, USA). При этом неспецифическое связывание конъюгатом блокировали добавлением в буфер 5% обезжиренного сухого молока. Затем мембрану снова отмывали в фосфатном буфере (7 раз по 10 мин). Детекцию полосы eNOS проводили методом усиленной хемолюминесценции (ECL). После отмывки в фосфатном буфере 7 раз по 10 мин мембрану обрабатывали соответствующим раствором (ECL, Amersham), как указано производителем, экспонировали на плёнку Hyperfilm-ECL (Amersham UK) в течение 2 ч в темноте. Полоску, соответствующую eNOS детектировали в соответствии с её молекулярной массой, устанавливаемой по сравнению с белками-метчиками. Плёнку высушивали на воздухе, полосы сканировали и рассчитывали площадь под кривой с использованием программы Total Lab. (рис. 2.1). .•у. ^______ eNOS, 140 kDa + + + ± ± Рисунок 2.1. Типичная авторадиофамма Вестсрн-блота, окрашенного оликлональными антителами против eNOS с последующей обработкой но методу ECL после его экспонирования с рентгеновской плёнкой «Hyperfilm» (Amersham). 31 2.4. Морфологические методы оценки сердечно-сосудистых изменений при моделировании L-NAME-нндуцироваиной ЭД2 Для морфологического подтверждения развития моделируемых патологических процессов и в комплексной оценке эффективности препаратов проведено гистологическое исследование сердца (во всех сериях эксперимента), почек, надпочечников, участков брюшной и сонной артерий). Материал фиксирован в 10% формалине с последующей заливкой в парафин. Использованы окраски гематоксилином Рего и эозином для выявления ранних повреждений миокардиоцитов, по Ван Гизон, ставилась ШИК-реакция. При морфометрии сердца использован метод раздельного взвешивания миокарда с определением индексов, определение диаметра кардиомиоцитов по методике Г.Г. Автандилова [1]. Определялись абсолютная и относительная масса надпочечников, в почках оценивался диаметр почечных телец и их клубочков. Определялось соотношение интима/медиа в участках сонной артерии и брюшной аорты. 2.5. Обоснование доз и дизайн эксперимента Согласно данным литературы, кардиотропные эффекты L-аргинина в экспериментах на крысах обнаруживаются в диапазоне доз от 10 до 600 мг/кг [123, 161, 166, 167, 208, 224]. При этом различают малые дозы 10-30 мг/кг, что соответствует суточной дозе L-аргинина в качестве БАД. Большие дозы L-аргинина используются в комплексной терапии ИБС, ХСН для коррекции эндотелиальной дисфункции и в качестве дополнительной терапии к донорам N0нитратам [20, 126, 151, 165, 168, 173, 174, 186, 187, 202, 206, 218, 227, 228]. Таким образом, описанные дозы L-аргинина 30 и 200 мг/кг использованы нами при проведении острой фармакологической пробы. “ Морфологические исследования проведены на базе морфологической лаборатории НИИ ЭМ КГМУ и патанатомического отделения Курской областной клинической больницы при консультативной и методической помощи доцента В.Т. Дудки, доцента А.В. Иванова и зав. отделением В.Г. Пирогова, за что выражаем им глубокую благодарность. 32 |