|
вать АТФ-азу фторидом натрия, в присутствии которого активность АЦ, наоборот, возрастает. Для фиксации можно рекомендовать перфузию глутаральдегидом. После фиксации в формальдегиде фермент не выявляется. Неферментативное расщепление АТФ не мешает реакции, если раствор нитрата свинца добавляется в инкубационную среду непосредственно перед употреблением. Хотя процесс катализируемого ионами свинца расщепления АТФ в целом протекает более интенсивно, чем аденилатциклазная реакция, он не может оказать существенного влияния на выявление фермента, поскольку на фоне этого равномерно протекающего процесса участки, в которых концентрируется ферментативная активность, выявляются достаточно fv четко. В нашем исследовании для выявления активности аденилатциклазы мы использовали свинцовый метод по Райку, Петцольду, Хиггинсу, Грингарду и Барнетту) (цит. по руководству Пирса «Гистохимия», 1962). Описание методики: 1.Фиксация перфузией 400 мл (для крысы) 1%-ного глутаральдегида на * 0,05 М какодилат-нитратном буфере (pH 7,4) с 4,5%-ной декстрозой. 2. Кусочки ткани, толщиной 2-3 мм промывать в течение ночи в буферном растворе 3. Вырезать маленькие полоски ткани ( <1 мм3). 4. Инкубация 30 минут при температуре 30°С. Состав инкубационной среды: 80мМ малеатный трис-буфер (pH —7,4), 8%-ная декстроза, 2.0 мМ теофиллин, 4.0 мМ сульфат магния, 0,5 мМ АТФ в 0,5 м. Непосредственно перед употреблением добавить 4,8 мМ Pb (N03)2. Контрольные опыты: а) инкубация в среде без субстрата, |
ханизме действия многих гормонов, образуется из АТФ под действием активируемой гормонами АЦ. При этой ферментативной реакции происходит отщепление пирофосфата (ПФ„) АЦ АТФ Аденизин-3', 5'-монофосфат +ПФН; РЬ 2+ Гистохимическое выявление активности АЦ основано на осаждении высвобождающегося пирофосфата при помощи ионов свинца. При этом необходимо отдифференцировать АЦ-реакцию от АТФ-азной активности. С этой целью можно либо исключить гормональную активацию АЦ, либо ингибировать АТФ-азу фторидом натрия, в присутствии которого активность АЦ, наоборот, возрастает. Для фиксации можно рекомендовать перфузию глутаральдегидом. После фиксации в формальдегиде фермент не выявляется. Неферментативное расщепление АТФ не мешает реакции, если раствор нитрата свинца добавляется в инкубационную среду непосредственно перед употреблением. Хотя процесс катализируемого ионами свинца расщепления АТФ в целом протекает более интенсивно, чем аденилатциклазная реакция, он не может оказать существенного влияния на выявление фермента, поскольку на фоне этого равномерно протекающего процесса участки, в которых концентрируется ферментативная активность, выявляются достаточно четко. В нашем исследовании для выявления активности аденилатциклазы мы использовали свинцовый метод по Райку, Петцольду, Хиггинсу, Грингарду и Барнетту). Описание методики: 1. Фиксация перфузией 400 мл (для крысы) 1%-ного глутаральдегида на 0,05 М какодилат-нитратном буфере (pH 7,4) с 4,5%-ной декстрозой. 2. Кусочки ткани, толщиной 2-3 мм промывать в течение ночи в буферном растворе. з3. Вырезать маленькие полоски ткани (<1 мм ). 4. Инкубация 30 минут при температуре 30°С. Состав инкубационной среды: 80мМ малеатный трис-буфер (рН7,4), 8%-ная декстроза, 2.0 мМ теофиллин, 4.0 мМ сульфат магния, 0,5 мМ АТФ в 0,5 м. Непосредственно перед употреблением добавить 4,8 мМ Pb (N03)2. Контрольные опыты: а) инкубация в среде без субстрата, б) инкубация в среде с 12,5 X 10 М NaF, в) инкубация с гормональной стимуляцией. 5.Промыть в забуференном растворе декстрозы. 6. Дополнительно фиксировать в 1%-ной OSO4 на буфере (pH 7,4) с 7,5%-ной декстрозой. веронал 7. Обезводить, залить в смесь эпон-аралдит и приготовить полутонкие срезы. Результат: осадок пирофосфата свинца маркирует места локализации фермента. Окрашенные таким образом препараты подвергали цитофотометрии. Цитофотометрирование. Активность АЦ в срезах десны животных оценивали количественно мещм цитофотометрии. Основой фотометрического исследования конечного продукта гистохимической реакции в клетках и тканях является закон Ламберта-Бера, согласно которому слои гомогенно поглощающей среды равной толщины поглощают равное количество света. При использовании красителей или гистохимических реакций окрашивания для выявления веществ в клетках и тканях количество связываемого красителя должно ли |