|
б) инкубация в среде с 12,5 х 10 М Na F, в) инкубация с гормональной стимуляцией. 5. Промыть в забуференном растворе декстрозы. 6. Дополнительно фиксировать в 1%-ной OsC>4на веронал-ацетатном буфере (pH 7,4) с 7,5%-ной декстрозой. 7. Обезводить, залить в смесь эпон-аралдит и приготовить полутонкие срезы Результат: осадок пирофосфата свинца маркирует места локализации фермента. Окрашенные таким образом препараты подвергали цитофотометрии. Цитофотометрирование. Активность АЦ в срезах десны животных оценивали количественно методом цитофотометрии (Автандилов Г.Г., 1973, 1980). Основой фотометрического исследования конечного продукта гистохимической реакции в клетках и тканях является закон Ламберта-Бера, согласно которому слои гомогенно поглощающей среды равной толщины поглощают равное количество света. При использовании красителей или гистохимических реакций окрашивания для выявления веществ в клетках и тканях количество связываемого красителя должно линейно зависеть от количества выявляемого вещества (стехеометричность связывания красителя). Фотометрирование для количественного определения обычно проводят при длине волны, при которой поглощение света продуктом реакции максимально. Максимум поглощения для этой реакции был при 540 нм. Измерение содержания АЦ осуществляется с помощью определения поглощения (экстинкции) в окрашенных участках клетки (метод зонда). Произвольные единицы вычисляются на основе данных по среднему оптическому поглощению и площади окрашенного участка. Для количественного определения относительной оптической плотности конечного продукта реакции при выявлении активности АЦ срезы десны контрольного и опытного животных цитофотометрировали на микроскопе |
з3. Вырезать маленькие полоски ткани (<1 мм ). 4. Инкубация 30 минут при температуре 30°С. Состав инкубационной среды: 80мМ малеатный трис-буфер (рН7,4), 8%-ная декстроза, 2.0 мМ теофиллин, 4.0 мМ сульфат магния, 0,5 мМ АТФ в 0,5 м. Непосредственно перед употреблением добавить 4,8 мМ Pb (N03)2. Контрольные опыты: а) инкубация в среде без субстрата, б) инкубация в среде с 12,5 X 10 М NaF, в) инкубация с гормональной стимуляцией. 5.Промыть в забуференном растворе декстрозы. 6. Дополнительно фиксировать в 1%-ной OSO4 на буфере (pH 7,4) с 7,5%-ной декстрозой. веронал 7. Обезводить, залить в смесь эпон-аралдит и приготовить полутонкие срезы. Результат: осадок пирофосфата свинца маркирует места локализации фермента. Окрашенные таким образом препараты подвергали цитофотометрии. Цитофотометрирование. Активность АЦ в срезах десны животных оценивали количественно мещм цитофотометрии. Основой фотометрического исследования конечного продукта гистохимической реакции в клетках и тканях является закон Ламберта-Бера, согласно которому слои гомогенно поглощающей среды равной толщины поглощают равное количество света. При использовании красителей или гистохимических реакций окрашивания для выявления веществ в клетках и тканях количество связываемого красителя должно ли нейно зависеть от количества выявляемого вещества (стехеометричность связывания красителя). Фотометрирование для количественного определения обычно проводят при длине волны, при которой поглощение света продуктом реакции максимально. Максимум поглощения для этой реакции был при 540 нм. Измерение содержания АЦ осуществляется с помощью определения поглощения (экстинкции) в окрашенных участках клетки (метод зонда). Произвольные единицы вычисляются на основе данных по среднему оптическому поглощению и площади окрашенного участка. Для количественного определения относительной оптической плотности конечного продукта реакции при выявлении активности АЦ срезы десны контрольного и опытного животных цитофотометрировали на микроскопе ЛЮМАМ-ИЗ с фотометрической насадкой. Измерения производили зондом, диаметром 0,5 мкм, в монохроматическом луче света с длиной волны 540 нм. Подсчет прореагировавших клеток проводили в 10 полях зрения при увеличении объектива *40. Таким образом, нами были получены данные о светооптической плотности АЦ в клетках фибробластического ряда в сравнении с нормальными показателями, которые мы исследовали у контрольных животных. В процессе работы нами проведено исследование у 5 групп животных (табл. 1). Таблица 1. Распределение экспериментальных животных в эксперименте. Виды воздействия Количество животных, используемых в эксперименте 1. Интактные животные 3 2. В/В введение кетонала 12 3. Л/Т введение кетонала 14 4. В/В введение кетонала в условиях экспериментального воспаления 13 5. Л/Т введение кетонала в условиях экспериментального воспаления 11 |