|
Анализ нативных препаратов проводили в сканирующем электронном* микроскопе Philips Р8ЕМ-500х со съемкой.на коммерческую широко-и узко-4 форматную пленку. 2.13. Методы гистологического исследованияДля изучения морфологической структуры исследуемых объектов нами использовались также гистологические методы исследования. Поскольку методики приготовления гистологических препаратов общеизвестны и широко используются, остановимся лишь ни их кратком изложении. Кусочки десны и регионарные лимфатические узлы фиксировали в 10% забуферен* 4 ном формалине (для приготовления парафиновых срезов, толщиной 7 мкм.и окрашивания гематоксилин-эозином) и в 2,5% растворе глутарового альдегида (для приготовления полутонких срезов, толщиной 1 мкм и оьфашивания их толуидиновым синим). Срезы изучали с помощью светового микроскопа при увеличении 16*10; 40*10; 100*10 (иммерсия). Для объективизации данных производилась фотосъемка на микроскопе МБИ-15 на пленку Микрат-300. 2.1.4. Иммуногистохимические методы Препараты для иммуногистохимического исследования готовили следующим образом: фиксированные в метакарне образцы тканей отмывали в метаноле, хлороформе и заливали в парапласт («Polyscienc Inc., США). Срезы с парапластовых блоков получали на микротоме «Autocut» («ReichertJung», Австрия), депарафинировали в толуоле и регидратировали в метаноле нисходящей концентрации и воде. Затем срезы обрабатывали 3% перекисью водорода (30 мин), промывали фосфатно-солевым буфером (0,1 М, pH 7,4) с 0,05% Tween-20, наносили раствор первых моноклональных антител, ковалентных ядерному антигену пролиферирующих клеток (PCNA), в который вносили 2% неиммунную сыворотку того животного, в котором были получены биотинилированные антитела против первых антител (в данном случае кролика). |
В 4 и 5 группах в результате передозировки наркотического препарата погибли 2 крысы до момента начала эксперимента. 2.1.2. Методы электронной микроскопии. В настоящее время сканирующая электронная микроскопия, на наш взгляд, является наиболее адекватной методикой морфологического исследования, поскольку на одном и том же препарате возможно исследование всех его конструктивных характеристик в широком диапазоне увеличения и на больших площадях. Для морфологического исследования мы использовали методику сканирующей электронной микроскопии нативных препаратов (СЭМНП). Для приготовления нативных препаратов лимфатические узлы отмывали от крови с помощью гепаринизированной среды 199 (ретроградная перфузия через брюшную аорту) и фиксировали перфузией 2,5% раствором глутарового альдегида на среде 199, дофиксировали в том же фиксаторе, обрабатывали 1% раствором осьмиевой кислоты, обезвоживали в этаноле восходящей концентрации. Из 96% этанола образцы замораживали в жидком азоте и раскалывали. После оттаивания в 96% этаноле процесс обезвоживания продолжался, препараты высушивали путем перехода через критическую точку в С02 и напыляли золотом или платиной. В ряде случаев раскалывания образцов не проводили, а исследовали препараты, резаные свежим лезвием бритвы после дофиксации. Анализ нативных препаратов проводили в сканирующем электронном микроскопе Philips Р8ЕМ-500х со съемкой на коммерческую широко-и узкоформатную пленку. 2.1.3. Методы гистологического исследования. Для изучения морфологической структуры исследуемых объектов нами использовались также гистологические методы исследования. Поскольку методики приготовления гистологических препаратов общеизвестны и широко используются, остановимся лишь ни их кратком изложении. Ку сочки десны и регионарные лимфатические узлы фиксировали в 10% забуференном формалине (для приготовления парафиновых срезов, толщиной 7 мкм и окрашивания гематоксилин-эозином) и в 2,5% растворе глутарового альдегида (для приготовления полутонких срезов, толщиной 1 мкм и окрашивания их толуидиновым синим). Срезы изучали с помощью светового микроскопа при увеличении 16*10; 40*10; 100*10 (иммерсия). Для объективизации данных производи-< лась фотосъемка на микроскопе МБИ-15 на пленку Микрат-300. 2.1.4. Иммуногистохимические методы. Препараты для иммуногистохимического исследования готовили следующим образом: фиксированные в метакарне образцы тканей отмывали в метаноле, хлороформе и заливали в парапласт («Polyscienc Inc., США). Срезы с парапластовых блоков получали на микротоме «Autocut» («Reichert-Jung,» Австрия), депарафинировали в толуоле и регидратировали в метаноле нисходящей концентрации и воде. Затем срезы обрабатывали 3% перекисью водорода (30 мин), промывали фосфатно-солевым буфером (0,1 М, pH 7,4) с 0,05% Tween-20, наносили раствор первых моноклональных антител, ковалентных ядерному антигену пролиферирующих клеток (PCNA), в который вносили 2% неиммунную сыворотку того животного, в котором были получены биотинилированные антитела против первых антител (в данном случае кролика). Срезы инкубировали с первыми антителами в течение 1 часа и затем трижды промывали 0,1% раствором бычьего сывороточного альбумина (БСА) на 0,1 М фосфатно-солевом буфере (ФСБ). Выявление связавшихся антител проводили с помощью иммуно-ферментного метода с использованием стрептавидин-биотиновых конъюгатов с пероксидазой хрена. Для этого на срезы, обработанные моноклональными первыми антителами, наносили вторые (противомышиные) биотинилированные IgG («Атегsham International pic» Великобритания). После одночасовой инкубации с |