|
Срезы инкубировали с первыми антителами в течение 1 часа и затем трижды промывали 0,1% раствором бычьего сывороточного альбумина (БСА) на 0,1 М фосфатно-солевом буфере (ФСБ). Выявление связавшихся антител проводили с помощью иммуно-ферментного метода с использованием стрептавидин-биотиновых конъюгатов с пероксидазой хрена. Для этого на срезы, обработанные моноклональными первыми антителами, наносили вторые (противомышиные) биотинилированные IgG («Amersham International pic» Великобритания). После одночасовой инкубации с противовидовыми антителами срезы промывали 0,1% раствором БСА и обрабатывали в течение 30 мин стрептавидин-биотиновым комплексом, связанным с пероксидазой xpeHa.(«Amersham International pic.»). Затем, для выявления пероксидазной активности на срезы на 10-15 мин наносили хромогенный субстрат, состоящий из одной части 3% перекиси водорода и 100 частей 0,05% раствора 3,3диаминобензидина («Serva», ФРГ) на 0,1 М фофатно-солевом буфере. По окончании хромогенной реакции с образованием окрашенного продукта срезы промывали дистиллированной водой, докрашивали метиленовым зеленым, обезвоживали, просветляли в толуоле и заключали в бальзам «Histomouth» («Мегк», ФРГ). Полученные препараты изучали в микроскопе МБИ15 (Россия). Проводили подсчет окрашенных моноклональными антителами клеток в 10 полях зрения при увеличении объектива *40 с последующей статистической обработкой. 2.2. Изучение фармакокинетики роцефина при различных способах его введения в условиях экспериментального воспаления. Концентрацию роцефина определяли в сыворотке крови, лимфы и регионарных (подчелюстных) лимфатических узлах у 37 беспородных собак, массой от 9,5 до 14,3 кг. Животные содержались с учетом рекомендаций хронобиологии и хрономедицины. Экспериментальным животным антибиотик вводили внутримышечно, эндолимфатически и лимфотропно в претрахеальную клетчатку в дозе 15 мг/кг массы животного. |
сочки десны и регионарные лимфатические узлы фиксировали в 10% забуференном формалине (для приготовления парафиновых срезов, толщиной 7 мкм и окрашивания гематоксилин-эозином) и в 2,5% растворе глутарового альдегида (для приготовления полутонких срезов, толщиной 1 мкм и окрашивания их толуидиновым синим). Срезы изучали с помощью светового микроскопа при увеличении 16*10; 40*10; 100*10 (иммерсия). Для объективизации данных производи-< лась фотосъемка на микроскопе МБИ-15 на пленку Микрат-300. 2.1.4. Иммуногистохимические методы. Препараты для иммуногистохимического исследования готовили следующим образом: фиксированные в метакарне образцы тканей отмывали в метаноле, хлороформе и заливали в парапласт («Polyscienc Inc., США). Срезы с парапластовых блоков получали на микротоме «Autocut» («Reichert-Jung,» Австрия), депарафинировали в толуоле и регидратировали в метаноле нисходящей концентрации и воде. Затем срезы обрабатывали 3% перекисью водорода (30 мин), промывали фосфатно-солевым буфером (0,1 М, pH 7,4) с 0,05% Tween-20, наносили раствор первых моноклональных антител, ковалентных ядерному антигену пролиферирующих клеток (PCNA), в который вносили 2% неиммунную сыворотку того животного, в котором были получены биотинилированные антитела против первых антител (в данном случае кролика). Срезы инкубировали с первыми антителами в течение 1 часа и затем трижды промывали 0,1% раствором бычьего сывороточного альбумина (БСА) на 0,1 М фосфатно-солевом буфере (ФСБ). Выявление связавшихся антител проводили с помощью иммуно-ферментного метода с использованием стрептавидин-биотиновых конъюгатов с пероксидазой хрена. Для этого на срезы, обработанные моноклональными первыми антителами, наносили вторые (противомышиные) биотинилированные IgG («Атегsham International pic» Великобритания). После одночасовой инкубации с противовидовыми антителами срезы промывали 0,1% раствором БСА и обрабатывали в течение 30 мин стрептавидин-биотиновым комплексом, связанным с пероксидазой xpeHa.(«Amersham International pic.»). Затем, для выявления пероксидазной активности на срезы на 10-15 мин наносили хромогенный субстрат, состоящий из одной части 3% перекиси водорода и 100 частей 0,05% раствора 3,3-диаминобензидина («Serva», ФРГ) на 0,1 М фофатно-солевом буфере. По окончании хромогенной реакции с образованием окрашенного продукта срезы промывали дистиллированной водой, докрашивали метиленовым зеленым, обезвоживали, просветляли в толуоле и заключали в бальзам «Plistomouth» («Мегк», ФРГ). Полученные Ф препараты изучали в микроскопе МБИ-15 (Россия). Проводили подсчет окрашенных моноклональными антителами клеток в 10 полях зрения при увеличении объектива *40 с последующей статистической обработкой. 2.2. Изучение состояния тканей пародонта и регионарных лимфатических узлов при воздействии физических факторов в процессе подготовки зубов к протезированию. Для изучения состояния тканей пародонта и реакции лимфоидных клеток лимфоузлов, в условиях перепада температуры и вибрации при моделировании условий механических воздействий на ткани коронки зуба, проведено экспериментальное исследование на белых крысах линии Wistar массой от 150 до 180г. С учетом рекомендаций хронобиологии и хрономедицины. Обработку коронковой части верхних и нижних резцов проводили дисками при скорости вращения 10000 оборотов. Животные были разбиты на 3 группы: интактные (3) и две экспериментальные, которым в течение двух этапов производили обработку зубов в режиме «щадящем» т. е. при воздействии на зуб однократно не более 2-х 3-х секунд (6) и «агрессивном», доводя контакт диска с зубом до 15-30 сек (6). (Таблица 2). Затем через 1, 3, 5 суток после завершения эксперимента проводили забор биоматериала (тканей пародонта и подчелюстных лим 2.3. Изучение фармакокинетики цефотаксима при различных способах его введения при экспериментальном воспалении. В эксперименте изучили фармакинетику цефотаксима при различных способах его введения при экспериментальном воспалении. Концентрацию цефотаксима определяли в сыворотке крови, лимфы и регионарных (подчелюстных) лимфатических узлах у 11 беспородных собак, массой от 9,5 до 14,3 кг. Животные содержались с учетом рекомендаций хронобиологии и хрономедицины (Комаров Ф.И., 1989). Экспериментальным животным антибиотик вводили внутривенно, эндолимфатически и лимфотропно в претрахеальную клетчатку в дозе 15 мг/кг массы животного. Для эндолимфатического введения антибиотика катетеризацию периферического лимфатического сосуда у животных осуществляли доступом на границе верхней и средней трети переднебоковой поверхности голени. Перед началом операции дистальнее предполагаемого разреза на 5-7 см, с целью идентификации лимфатических сосудов, вводили 1-2 мл 0,4% раствора индигокармина. Обезболивание в процессе эксперимента осуществляли внутриплевральным введением нембутала (этаминала натрий). Данный препарат относится к средствам, влияющим на центральную нервную систему. Нембутал оказывает снотворное, а в более высоких дозах наркотическое действие. Препарат вводили внутримышечно в виде 5% раствора в объеме 5-10 мл. Сон наступал относительно быстро (через 30-45 мин) и продолжался 5-6 часов. Вывод животных из эксперимента производился передозировкой наркотического вещества. Определение концентрации антибиотика производили в сыворотке крови, лимфе и регионарных (подчелюстных) лимфатических узлах собак через 1, 3, 6, 9, 12, 18, 24, 36 и 48 часов после введения цефотаксима. |