Проверяемый текст
Лазаренко Галина Степановна. Исследование эндотелиопротективного эффекта L-аргинина и его комбинаций с эналаприлом и лозартаном (Диссертация 2006)
[стр. 43]

Multiskan MCC/340 составляет 1,7 мкМ.
Для колориметрического определения нитрит-иона использовали реактив Грисса, состоящий из равных частей раствора I (0,05% раствор N-нафтилэтилендиамина в воде) и раствора II (1% раствор сульфаниламида в 30% уксусной кислоте)
[68].
Оба раствора хранятся в темноте при температуре 4°С в течение нескольких месяцев.
Для
приготовления раствора хлористого ванадия 400 мг VC13 растворяли в 50 мл IN НС1 с последующим фильтрованием через бумажный фильтр.
Всегда использовали свежеприготовленный раствор.
Уровень метаболитов N0 (то есть суммарную концентрацию нитратов и нитритов, NOx) определяли колориметрическим методом по развитию окраски в реакции диазотирования нитритом сульфаниламида, входящего в состав реактива Грисса.
Для построения калибровочной кривой использовали 1М раствор
NaN02 в воде, который хранили при температуре -20°С; перед употреблением его разводили в 1000 раз и готовили серию разведений для построения кривой.
2.5.
Морфологические методы оценки сердечно-сосудистых изменений при моделировании
L-NAME-индуцировашюй ЭД Для морфологического подтверждения развития моделируемых патологических процессов и в комплексной оценке эффективности препаратов проведено гистологическое исследование сердца (во всех сериях эксперимента, почек, надпочечников, участков брюшной и сонной артерий).
Материал фиксирован в 10% формалине с последующей
запивкой в парафин.
Использованы окраски гематоксилином Рего и эозином для выявления ранних повреждений миокардиоцитов, по Ван Гизон, ставилась ШИКреакция.
При морфометрии сердца использован метод раздельного взвешивания миокарда с определением индексов, определение диаметра кардиомиоцитов по методике Г.Г.
Автандилова
[2].
Определялись абсолютная и относительная масса надпочечников, в почках оценивался
43
[стр. 29]

1.
Нагрузка объёмом (внутривенное одномоментное введение0,9 % раствора NaCl, из расчёта 0,4 мл на 100 г) [34, 43 44].
2.
Проба на адрснореактивность (внутривенное одномоментное введение раствора адреналина гидрохлорида Г10'5моль/л, из расчёта 0,1 мл на 100 г) [34, 43 44].
3.
Нагрузка сопротивлением (пережатие восходящей аорты на 30 сек [34, 43 44].
4.
3 минутную гипоксию [85, 87].
2.3.
Биохимические маркеры эндотелиальной дисфункции 1 Нами использована модификация метода определения стабильных метаболитов NO, позволяющая после депротеинизации сыворотки крови проводить одноэтапное количественное определение суммарных нитратов и нитритов [69].
Принцип метода заключается в одновременном восстановлении нитратов в нитриты в присутствии хлористого ванадия и реакции диазотирования с последующим развитием окраски, интенсивность которой определяли спектрофотометрически при длине волны 540 нм.
Анализ 100 мкл депротеинизироваиной сыворотки проводили в 96 луночных планшетах с плоским дном.
Чувствительность метода на приборе Labsystems Multiskan МСС/340 составляет 1,7 мкМ.
Для колориметрического определения нитритиона использовали реактив Грисса, состоящий из равных частей раствора I (0,05% раствор N-нафтилэтилендиамина в воде) и раствора II (1% раствор сульфаниламида в 30% уксусной кислоте)
[69].
Оба раствора хранятся в темноте при температуре 4°С в течение нескольких месяцев.
Для
приготов1 Биохимические исследования показателей Total NO и активности NOсинтазы проведены в соответствии с договором (предмет договора «Биохимическое определение маркёров функционального состояния эндотелия», № 15/12 от 27 декабря) о научно-техническом сотрудничестве между КГМУ и Государственным учреждением «Государственный Научноисследовательский центр профилактической медицины М3 РФ (ГНИЦ ИМ М3 РФ)», г.
Москва на базе лаборатории под руководством профессора В А.
Метельской, за что выражаем сотрудникам глубокую благодарность.
29

[стр.,30]

ления раствора хлористого ванадия 400 мг VCI3 растворяли в 50 мл IN HCI с последующим фильтрованием через бумажный фильтр.
Всегда использовали свежеприготовленный раствор.
Уровень метаболитов N0 (то есть суммарную концентрацию нитратов и нитритов, NOx) определяли колориметрическим методом по развитию окраски в реакции диазотирования нитритом сульфаниламида, входящего в состав реактива Грисса.
Для построения калибровочной кривой использовали 1М раствор
NaNCb в воде, который хранили при температуре -20°С; перед употреблением его разводили в 1000 раз и готовили серию разведений для построения кривой.
Уровень экспрессии эндотелиальной синтазы оксида азота (e-NOS) определяли в клеточном лизате по методу R.J.
Hendrickson [112] с небольшими модификациями.
По окончании инкубации клеток с исследуемой сывороткой человека их трижды промывали 5 мМ фосфатным буфером, pH 7,4, клетки из одной лунки собирали в 100 мкл лизирующего буфера: 0,1 М ацетат Na, pH 6,8, содержащего 5 мМ ЭДТА и 3% додецилсульфат Na (SDS), центрифугировали 10 мин при 1000 х g и подвергали электрофорезу в полиакриламидном геле (ПААГ) в присутствии SDS, согласно методу [112].
В лунку наносили 20 мкг белка.
На каждую пластину наносили смесь предварительно окрашенных белков-метчиков с диапазоном молекулярной массой (М.м.) 7000-200000 Да (Bio-Rad Kaleidoscope Prestained Standards, USA), что позволяло идентифицировать полосу, соответствующую eNOS (М.м.
которой 140000 Да).
Белок в клеточном лизате опредляли по методу Lowry с использованием БСА в качестве стандарта.
По окончании электофореза осуществляли перенос белков с геля на нитроцеллюлозную мембрану Вестерн-блот (60 В, 1 час).
Эффективность переноса определяли с помощью обратимого окрашивания мембран белковым красителем Ponceau Red (Sigma, USA).
После трёхкратной отмывки мембраны 5 мМ фосфатным буфером, pi I 7,4, содержащим 150 мМ NaCl и 0,05% твина-200, её в течение ночи обрабатывали раствором поликлональ30

[стр.,32]

2.4.
Морфологические методы оценки сердечно-сосудистых изменений при моделировании
L-NAME-нндуцироваиной ЭД2 Для морфологического подтверждения развития моделируемых патологических процессов и в комплексной оценке эффективности препаратов проведено гистологическое исследование сердца (во всех сериях эксперимента), почек, надпочечников, участков брюшной и сонной артерий).
Материал фиксирован в 10% формалине с последующей
заливкой в парафин.
Использованы окраски гематоксилином Рего и эозином для выявления ранних повреждений миокардиоцитов, по Ван Гизон, ставилась ШИК-реакция.
При морфометрии сердца использован метод раздельного взвешивания миокарда с определением индексов, определение диаметра кардиомиоцитов по методике Г.Г.
Автандилова
[1].
Определялись абсолютная и относительная масса надпочечников, в почках оценивался
диаметр почечных телец и их клубочков.
Определялось соотношение интима/медиа в участках сонной артерии и брюшной аорты.
2.5.
Обоснование доз и дизайн эксперимента Согласно данным литературы, кардиотропные эффекты L-аргинина в экспериментах на крысах обнаруживаются в диапазоне доз от 10 до 600 мг/кг [123, 161, 166, 167, 208, 224].
При этом различают малые дозы 10-30 мг/кг, что соответствует суточной дозе L-аргинина в качестве БАД.
Большие дозы L-аргинина используются в комплексной терапии ИБС, ХСН для коррекции эндотелиальной дисфункции и в качестве дополнительной терапии к донорам N0нитратам [20, 126, 151, 165, 168, 173, 174, 186, 187, 202, 206, 218, 227, 228].
Таким образом, описанные дозы L-аргинина 30 и 200 мг/кг использованы нами при проведении острой фармакологической пробы.
“ Морфологические исследования проведены на базе морфологической лаборатории НИИ ЭМ КГМУ и патанатомического отделения Курской областной клинической больницы при консультативной и методической помощи доцента В.Т.
Дудки, доцента А.В.
Иванова и зав.
отделением В.Г.
Пирогова, за что выражаем им глубокую благодарность.
32

[Back]