|
5.3.2.2. Методика определения остеокалъцина в сыворотке крови Остеокальцин или костный Gla белок это основной неколлагеновый белок костной ткани, связывающий гидроксиапатит. Он имеет молекулярную массу 5800 Da и состоит из 49 аминокислотных остатков, включая три остатка у-карбоксиглутаминовой кислоты. ОКЦ синтезируется остеобластами, одонтобластами и, в меньшей степени, гипертрофированными хондроцитами. После образования он частично включается в костную ткань, частично попадает в систему циркуляции. Биологическая функция остеокальцина до настоящего времени окончательно не определена, однако, последние исследования подверждают его участие не только в процессе минерализации вновь сформированного остеоида, но и в активации остеокластов. Вместе с тем, между уровнем остеокальцина в крови и скоростью костеобразования имеется корреляция, что позволяет считать остеокальцин специфическим маркером функции остеобластов (356). Показано, что уровень циркулирующего остеокальцина отражает скорость образования кости. Установлено, что измерение сывороточного остеокальцина позволяет определять риск развития остеопороза у женщин; проводить мониторинг костного метаболизма во время менопаузы и после нее; во время гормональной заместительной терапии и терапии антагонистами лютеинрелизинг фактора; помогает в диагностировании пациентов с дефицитом гормона роста, гипои гипертиреозом, хроническими заболеваниями почек. Для количественного определения ОКЦ сыворотки крови мы использовали двухцентровую иммуноферментную тест-систему Osteometer BioTech A/S N-MID™ Osteocalcin One Step ELISA. Принцип метода основан на высокой специфичности двух моноклональных антител (Mabs) к человеческому остеокальцину. Одни антитела распознают среднюю часть (аминокислотные остатки 20-43) полипептида, захватывая его, а другие, конъюгированные с пероксидазой, узнают N-конечную область (аминокислотные остатки 20-43). Детектируются интактный (1-49) и N-конечный (Mid) (1-43) фрагменты остеокальцина. Сбор образцов производили следующим образом: центрифугировали венозную кровь, отделяли сыворотку от клеток (не позднее 3 часов после забора |
рялся. Результат умножался на фактор разбавления. Для каждого образца вычисление результатов CrossLaps™ проводилось с поправкой на концентрацию креатинина в моче (мМ=ммоль/л). Определение концентрации креатинина в моче проводилось биохимическим методом с использованием наборов фирмы “LACHEMA”. Принцип метода состоит в том, что в щелочной среде пикриновая кислота взаимодействует с креатинином с образованием оранжево-красной окраски, которую измеряют фотометрически при длине волны 510 нм. Определение в моче проводят после разведения водой. Приведённая ниже формула нормирует значения концентрации CrossLaps™ относительно вариаций в концентрации мочи: Исправленное значение CrossLaps™ (мкг/ммоль) CrossLaps (мкг/л) Креатинин (мМ). Согласно данным фирмы производителя предел чувствительности 50 мкг/л. Норма 49-460 мкг/ммоль креатинина. 5.3.2.2. Методика определения остеокальцина в сыворотке крови Количественное определение ОКЦ в сыворотке крови проводилось с использованием двухцентровой иммуноферментной тест-системой Osteometer BioTech A/S N-MID™ Osteocalcin One Step ELISA. ОКЦ или костный Gla белок это основной неколлагеновый белок костной ткани, связывающий гидроксиапатит. Он имеет молекулярную массу 5800 Da и состоит из 49 аминокислотных остатков, включая три остатка укарбоксиглутаминовой кислоты. ОКЦ синтезируется в костных ОБ, одонтобластами и, в меньшей степени, гипертрофированными хондроцитами. После образования он частично включается в костную ткань, частично попадает в систему циркуляции. Точно физиологическая функция ОКЦ все еще не установлена. Большое количество исследований показало, что уровень циркулирующего ОКЦ коррелирует со скоростью образования кости, что позволяет считать его специфическим маркером функции ОБ (394). Тест-система основана на использовании двух высоко специфических моноклональных АТ к человеческому ОКЦ. Одни АТ узнают среднюю часть (аминокислотные остатки 20-43) полипептида, захватывая его, а другие, конъюгированные с пероксидазой, узнают N-конечную область (аминокислотные остатки 20-43). Дополнительно к интактному ОКЦ (1-49) детектируется N-конечный (Mid) фрагмент (1-43). Перед исследование все компоненты набора приняли комнатную температуру (18-25° С), все анализы дублировались, 14 ячеек использовались для стандартов и контролен. В начале исследования вносилось по 20 pL стандартов (A-F), контролен (СО) и образцов в соответствующие ячейки, покрытые стрептавидином, после чего добавлялось по 150 uL смеси биотинилированпероксидазои это готовые буферы с белковым стабилизатором , консервантом и с разной концентрацией синтетического человеческого ОКЦ: А=0 нг/мл, В=6,7 нг/мл, С=8,1 нг/мл, D=12,8 нг/мл, Е=33,3 нг/мл, F=117,0 нг/мл. Контроль (СО) это раствор синтетического человеческого ОКЦ с белковым стабилизатором и консервантом. Затем закрытые изолентой стрипы инкубировались в течение 120±5 минут при комнатной температуре (18-20°С) без встряхивания. Во время инкубации образуется комплекс между АГ и АТ, который сорбируется на поверхности, покрытой стрептавидином, через биотинилированные АТ. Следом проводилась 5-ти кратная промывка ячеек отмывающим буфером, разбавленным 1:50 дистиллированной водой. На следующем этапе исследования вносилось по 100 pL раствора субстрата в каждую ячейку и проводилась инкубация 15±2 мин в темноте при комнатной температуре. Затем после добавления 100 pL раствора 0,18 М серной кислоты происходила остановка цветной реакции, и проводилось измерение оптической плотности в ячейках при 450 нм в течение 2-х часов. При расчете результатов с начало определялись средние значения для дублей оптических плотностей за вычетом средней оптической плотности для стандарта А (бланк). Затем строилась стандартная кривая, где по оси ор |