крови). Образцы замораживались при температуре -40°С в холодильной камере. При растворении лиофилизованных препаратов после добавления дистиллифлаконы выдерживались минут до встряхивания пользовании набора все компоненты должны быть комнатной температуры (1825° С). Требуемое количество стрипов располагалось в рамке. До использования, стрипы хранились в плотно запечатанном пакете с упаковками водопоглотителя. Все анализы дублировались, 14 ячеек использовались для стандартов и контролен. Стандарты (синтетический остеокальцин), контроли и образцы вносятся в соответствующие ячейки, после чего наносится смесь биотинилированных антител и антител, конъюгированных с пероксидазой. Образовавшийся комплекс между антигеном и антителами сорбируется на поверхности, покрытой стрептавидином, через биотинилированные антитела. После добавления субстрата ТМБ и остановки реакции серной кислотой измеряются оптические плотности в ячейках при 450 нм. Затем смешивался коньюгат моноклональных антител против Nтерминального отрезка остеокальцина с пероксидазой и биотинилированные моноклональные антитела против mid-отрезка остеокальцина по 10 мл в равных мкл F), контролей (СО) образцов в соответствующие ячейки, затем добавлялось по 150 мкл смеси растворов антител. Стандарты это готовые буферы с белковым стабилизатором, консервантом и с разной концентрацией синтетического человеческого остеокальцина: А=0 нг/мл, В=6,7 нг/мл, С=8,1 нг/мл, D—12,8 нг/мл, Е=33,3 нг/мл, F=117,0 нг/мл. Контроль СО это раствор синтетического человеческого остеокальцина с белковым стабилизатором и консервантом. Стрипы заклеивались пленкой и инкубировались 120±5 мин при температуре 18-22°С без встряхивания. После этого стрипы 5 раз обрабатывались отмывающим буфером, разбавленным 1 осушались ждым циклом промывки. |
Тест-система основана на использовании двух высоко специфических моноклональных АТ к человеческому ОКЦ. Одни АТ узнают среднюю часть (аминокислотные остатки 20-43) полипептида, захватывая его, а другие, конъюгированные с пероксидазой, узнают N-конечную область (аминокислотные остатки 20-43). Дополнительно к интактному ОКЦ (1-49) детектируется N-конечный (Mid) фрагмент (1-43). Перед исследование все компоненты набора приняли комнатную температуру (18-25° С), все анализы дублировались, 14 ячеек использовались для стандартов и контролен. В начале исследования вносилось по 20 pL стандартов (A-F), контролен (СО) и образцов в соответствующие ячейки, покрытые стрептавидином, после чего добавлялось по 150 uL смеси биотинилированпероксидазои это готовые буферы с белковым стабилизатором , консервантом и с разной концентрацией синтетического человеческого ОКЦ: А=0 нг/мл, В=6,7 нг/мл, С=8,1 нг/мл, D=12,8 нг/мл, Е=33,3 нг/мл, F=117,0 нг/мл. Контроль (СО) это раствор синтетического человеческого ОКЦ с белковым стабилизатором и консервантом. Затем закрытые изолентой стрипы инкубировались в течение 120±5 минут при комнатной температуре (18-20°С) без встряхивания. Во время инкубации образуется комплекс между АГ и АТ, который сорбируется на поверхности, покрытой стрептавидином, через биотинилированные АТ. Следом проводилась 5-ти кратная промывка ячеек отмывающим буфером, разбавленным 1:50 дистиллированной водой. На следующем этапе исследования вносилось по 100 pL раствора субстрата в каждую ячейку и проводилась инкубация 15±2 мин в темноте при комнатной температуре. Затем после добавления 100 pL раствора 0,18 М серной кислоты происходила остановка цветной реакции, и проводилось измерение оптической плотности в ячейках при 450 нм в течение 2-х часов. При расчете результатов с начало определялись средние значения для дублей оптических плотностей за вычетом средней оптической плотности для стандарта А (бланк). Затем строилась стандартная кривая, где по оси ор |