|
способом путем измерения электрохимического потенциала мембраны. Из-за технических трудностей результаты, полученные таким способом разными методами, значительно расходятся (16). Существует подход, при котором используются положительно заряженные флуоресцентные липофильные красители цианин и оксанол, способные проникать через мембрану лимфоцита. Когда в течение непродолжительного времени при активации клеточные мембраны деполяризуются (внутренняя часть клетки при этом становится менее отрицательно заряженной), краситель выходит из клетки. В результате можно следить флуоресценции клетки (319). Натриевый насос имеется, по-видимому, во всех клетках. В ряде исследований с использованием меченого оуабаина было подсчитано количество молеАТФ-азы в мембране. Так, в эритроцитах фермента на одну клетку; в других клетках 100-200 молекул энзима. Максимальное количество фермента содержат почки, где обмен веществ наиболее интенсивный. В почечной ткани роль АТФ-азы связана с + регуляцией водно-солевого баланса (37) тканях (нервная, мышечная) особое значение приобретает электрогенность Naнасоса (6). В экспериментах на животных была показана ключевая роль Na,KАТФ-азы в транспорте медиатора норадреналина в нервных окончаниях коры головного мозга (195). АТФ-аза является наиболее важным фактором в индуцированной глюкозой секреции инсулина панкреатическими (1-клетками (362). АТФ-аза кардиомиоцитов играет ключевую роль в механизме ФранкаСтарлинга (99). Существует ряд веществ, избирательно ингибирующих NajK-АТФ-азу. К ним относится оуабаин, или строфантин G, кардиотонический гликозид, который широко используется в исследованиях натриевого насоса. Интересно, что он является потенциальным ингибитором синтеза белков, ДНК и РНК в Ти Влимфоцитах. Все человеческие изозимы АТФ-азы высокоаффинны к данному препарату. Оуабаин присоединяется к АТФ-азе с наружной стороны плазмати |
образуется разность потенциалов, которая уравновешивает избыток концентрации вещества внутри клетки равновесие Доннана. Натриевый насос участвует также в создании градиента концентрации ионов, необходимого для передачи нервного импульса, и в переносе через мембрану других веществ с использованием механизмов симпорта и антипорта (143,22). Существуют различные методики определения уровня активности АТФазы в эксперименте. В ряду исследований использовался подсчет количества неорганического фосфата, высвобожденного в результате гидролиза АТФ. Результат при таком способе определения выражался в молях/час/мл протеина (263). Кроме того, в литературе упоминается об исследовании активности АТФазы колориметрическим методом (384,813). Некоторые авторы в исследованиях использовали люциферин-люциферазный метод (387). Активность АТФ-азы можно измерить косвенным путем, определяя спекгрофотометрическим способом количество абсорбированных атомов Na* и К+ (339). Также функция фермента в некоторых экспериментах оценивалась при помощи меченого изотопа рубидия, который захватывается активированной молекулой АТФ-азы (638). Исследование активности АТФ-азы в лимфоцитах можно проводить косвенным способом путем измерения электрохимического потенциала мембраны. Из-за технических трудностей результаты, полученные таким способом разными методами, значительно расходятся (64). Существует подход, при котором используются положительно заряженные флуоресцентные липофильные красители цианин и оксанол, способные проникать через мембрану лимфоцита. Когда в течение непродолжительного времени при активации клеточные мембраны деполяризуются (внутренняя часть клетки при этом становится менее отрицательно заряженной), краситель выходит из клетки. В результате можно следить за деполяризацией мембраны по уменьшению интенсивности флуоресценции клетки (674). Натриевый насос имеется, по-видимому, во всех клетках. В ряде исследований с использованием меченого оуабаина было подсчитано количество молекул Na.K-АТФ-азы в мембране. Так, в эритроцитах обнаруживается 1 0 0 2 0 0 молекул фермента на одну клетку; в других клетках содержится до миллиона молекул энзима. Максимальное количество фермента содержат почки, где обмен веществ наиболее интенсивный. В почечной ткани роль АТФ-азы связана с реабсорбцией Na+ и регуляцией водно-солевого баланса (142). В возбудимых тканях (нервная, мышечная) особое значение приобретает электрогенность Na-насоса (14). В экспериментах на животных была показана ключевая роль Na.K-АТФ-азы в транспорте медиатора норадреналина в нервных окончаниях коры головного мозга (433). АТФ-аза является наиболее важным фактором в индуцированной глюкозой секреции инсулина панкреатическими р-клетками (768). АТФ-аза кардиомиоцитов играет ключевую роль в механизме Франка-Старлинга (268). Установлено, что активность АТФ-азы подвержена возрастным изменениям. В эксперименте на животных было продемонстрировано повышение уровня АТФ-азы на 50% в мышечной ткани зрелых особей по сравнению с юными, что сопровождалось нарушением соотношения между изоформами: а 1 и р1 -субъединицы обнаруживали увеличение экспрессии, тогда как а2 и р2 -субъединицы отличались сниженным синтезом (730). Отмечается большая лабильность активности фермента у молодых особей при воздействии на них ингибиторов АТФ-азы (790). Диета также влияет на уровень активности АТФ-азы. Было показано, что назначение животным в эксперименте гиперхолестероловой диеты вело к значительному снижению активности фермента; этот эффект нивелировался приемом витамина Е (217). По данным некоторых авторов, наблюдалось повышение активности васкулярной АТФ-азы при ожирении у экспериментальных животных (401). Существует ряд веществ, избирательно ингибирующих Na.K-АТФ-азу. К ним относится оуабаин, или строфантин G, кардиотонический гликозид, который широко используется в исследованиях натриевого насоса. Интересно, что он является потенциальным ингибитором синтеза белков, ДНК и РНК в Ти В-лимфоцитах. Все человеческие изозимы АТФ-азы высокоаффинны к данному препарату. Оуабаин присоединяется к АТФ-азе с наружной стороны плазматической мембраны. Аминокислоты а-субъединицы способны изменять участок, чувствительный к оуабаину, в двух больших областях: одна включена в первый и второй трансмембранные домены и экстрацеллюлярную петлю, их соединяющую, а вторая сформирована экстрацеллюлярными половинами трансмембранных регионов IV, V, VI и VII (541). Наиболее чувствительна к оуабаину в эксперименте а-изоформа АТФ-азы (628), возможно, вследствие того, что оуабаин принимает участие в экспрессии генной последовательности, кодирующей а-субъединицу фермента; назначение его в эксперименте ведет к |