|
лось по 15 мкл стандартов (пробирки A-F), контроля (пробирка СО) или исследуемых образцов. В каждую лунку добавлялось по 100 мкл раствора первичных антиCross Laps антител. Стрипы закрывались пленкой и инкубовались 60±5 мин при комнатной температуре на микропланшетном шейкере (300 об/мин). Промывание стрипов производилось 5 раз промывочным раствором, разбавленным дистиллированной водой в соотношении 1:50. Затем в каждую лунку вносилось по 100 мкл конъюгата пероксидазы с антителами к Ig кролика. Стрипы закрывались, инкубировались 60±5 мин при комнатной температуре на микропланшетном шейкере (300 об/мин) и промывались как описано выше. Хромогенный субстрат (тетраметилбензидин) вносился по 100 мкл раствора в каждую лунку, стрипы закрывались и инкубировались 15±2 мин при комнатной температуре в темноте на микропланшетном шейкере (300 об/мин). Цветная реакция останавливалась добавлением 100 мкл стоп-реагента (0,18 М сульфуриловой кислоты) в каждую лунку. Измерение оптической плотности производилось при длине волны 450 нм. При расчёте результатов вычислялось среднее значение поглощения в двух последовательностях. Строилась калибровочная кривая на координатной плоскости с полулогарифмическим масштабом (см. рис. 3). По ординате откладывали средние значения поглощения шести стандартов (A-F), а по абсциссе соответствующие значения концентраций CrossLaps™. Опредлялась концентрация контроля мочи и исследуемых образцах путем интерполяции калибровочной кривой. Образцы с оптической плотностью, близкой к значению поглощения стандарта с наибольшей концентрацией (стандарт F), разбавляли в анализ зультат умножали на фактор разбавления. Вычисление результатов CrossLaps™ производилось с поправкой на концентрацию креатинина. Определение креатинина проводилось биохимическим методом с помощью набора Lachema. Принцип метода следующий: в щелочной среде пикриновая кислота взаимодействует с креатинином с образованием оранжево-красной окраски, которую измеряют |
стабилизатор, детергент, консервант и различную концентрацию CrossLaps антигена: А=0 пг/мл, В=110 пг/мл, С —275 пг/мл, D —825 пг/мл, Е=2475 пг/мл, F анализом исследуемая моча разбавлялась дартом А в соотношении 1:4, в объёме 50 мкл образца + 200 мкл стандарта А. Затем в каждую лунку добавлялось по 100 мкл раствора первичных кроличьих анти-CrossLaps™ антител, и закрытые изолентой стрипы инкубировались 60±5 мин при комнатной температуре (18-22°С) на микропланшетном шейкере (300 об/мин). После 5 кратной промывки лунок в них вносилось по 100 мкл конъюгата пероксидазы с антителами к иммуноглобулину кролика, и проводилась инкубация в течение 60±5 мин при комнатной температуре на микропланшетном шейкере (300 об/мин). После второй промывки проводилась ещё одна инкубация в течение 15±2 мин при комнатной температуре в темноте на микропланшетном шейкере (300 об/мин) со 100 мкл хромогенного субстрата, содержащего тетраметилбензидин в растворе кислоты. На последнем этапе исследования в каждую лунку вносилось по 100 мкл стопреагента (0,18 М серная кислота), и реакция останавливалась. Измерение поглощения проводилось на 450 нм не позднее 2-х часов после остановки реакции. Для сравнения использовался фильтр с длиной волны 650 нм. Расчёт результатов проводился методом вычисления среднего значения поглощения в двух последовательностях. Строилась калибровочная кривая на координатной бумаге с полулогарифмическим масштабом, по оси ординат откладывались средние значения поглощения шести стандартов (A-F), а по оси концентраций CrossLaps™. Для го использовалась 4-х параметрическая компьютерная аппроксимация. Определялась концентрация контроля (СО) и исследуемых образцов путём интерполяции калибровочной кривой. Значение концентрации CrossLaps™, определённое для контроля (СО), попало в диапазон, указанный в сопроводительном листе. Образцы с оптической плотностью, близкой к значению поглощения стандарта с наибольшей концентрацией (стандарт F), разбавлялись в соотношении 1:4 стандартом А в отдельной пробирке, и анализ повто рялся. Результат умножался на фактор разбавления. Для каждого образца вычисление результатов CrossLaps™ проводилось с поправкой на концентрацию креатинина в моче (мМ=ммоль/л). Определение концентрации креатинина в моче проводилось биохимическим методом с использованием наборов фирмы “LACHEMA”. Принцип метода состоит в том, что в щелочной среде пикриновая кислота взаимодействует с креатинином с образованием оранжево-красной окраски, которую измеряют фотометрически при длине волны 510 нм. Определение в моче проводят после разведения водой. Приведённая ниже формула нормирует значения концентрации CrossLaps™ относительно вариаций в концентрации мочи: Исправленное значение CrossLaps™ (мкг/ммоль) CrossLaps (мкг/л) Креатинин (мМ). Согласно данным фирмы производителя предел чувствительности 50 мкг/л. Норма 49-460 мкг/ммоль креатинина. 5.3.2.2. Методика определения остеокальцина в сыворотке крови Количественное определение ОКЦ в сыворотке крови проводилось с использованием двухцентровой иммуноферментной тест-системой Osteometer BioTech A/S N-MID™ Osteocalcin One Step ELISA. ОКЦ или костный Gla белок это основной неколлагеновый белок костной ткани, связывающий гидроксиапатит. Он имеет молекулярную массу 5800 Da и состоит из 49 аминокислотных остатков, включая три остатка укарбоксиглутаминовой кислоты. ОКЦ синтезируется в костных ОБ, одонтобластами и, в меньшей степени, гипертрофированными хондроцитами. После образования он частично включается в костную ткань, частично попадает в систему циркуляции. Точно физиологическая функция ОКЦ все еще не установлена. Большое количество исследований показало, что уровень циркулирующего ОКЦ коррелирует со скоростью образования кости, что позволяет считать его специфическим маркером функции ОБ (394). |