|
31 Для оценки функциональных возможностей миокарда у животных проводили нагрузочные пробы в представленной последовательности: 1. Нагрузка объёмом (внутривенное одномоментное введение0,9% раствора NaCl, из расчёта 0,4 мл на 100 г) [34, 43, 44]. 2. Проба на адренореактивность (внутривенное одномоментное введение раствора адреналина гидрохлорида Г10'5моль/л, из расчёта 0,1 мл на 100 г) [34, 43,44]. 3. Нагрузка сопротивлением (пережатие восходящей аорты на 30 сек [34,43,44]. 4. 3 минутную гипоксию [84, 86]. 2.3. Биохимические маркеры эндотелиальной дисфункции1 Нами использована модификация метода определения стабильных метаболитов NO, позволяющая после депротеинизации сыворотки крови проводить одноэтапное количественное определение суммарных нитратов и нитритов [68]. Принцип метода заключается в одновременном восстановлении нитратов в нитриты в присутствии хлористого ванадия и реакции диазотирования с последующим развитием окраски, интенсивность которой определяли спектрофотометрически при длине волны 540 нм. Анализ 100 мкл депротеинизированной сыворотки проводили в 96 луночных планшетах с плоским дном. Чувствительность метода на приборе Labsystems Multiskan MCG/340 составляет 1,7 мкМ. Для колориметрического определения нитрит-иона использовали реактив Грисса, состоящий из равных частей раствора 1 (0,05% раствор N-нафтилэтилендиамина в воде) и раствора II (1% раствор сульфаниламида в 30% уксусной кислоте) [68]. Оба раствора хранятся в темноте при температуре 4°С в течение нескольких месяцев. Для приготовления раствора хлористого ванадия 400 мг VC13 растворяли в 50 мл IN НС1 с последующим фильтрованием через бумажный фильтр. Всегда использовали свежеприготовленный раствор. Уровень метаболитов N0 (то есть суммарную концентрацию нитратов и нитритов, NOx) определяли колориметрическим методом по развитию |
1. Нагрузка объёмом (внутривенное одномоментное введение0,9 % раствора NaCl, из расчёта 0,4 мл на 100 г) [34, 43 44]. 2. Проба на адрснореактивность (внутривенное одномоментное введение раствора адреналина гидрохлорида Г10'5моль/л, из расчёта 0,1 мл на 100 г) [34, 43 44]. 3. Нагрузка сопротивлением (пережатие восходящей аорты на 30 сек [34, 43 44]. 4. 3 минутную гипоксию [85, 87]. 2.3. Биохимические маркеры эндотелиальной дисфункции 1 Нами использована модификация метода определения стабильных метаболитов NO, позволяющая после депротеинизации сыворотки крови проводить одноэтапное количественное определение суммарных нитратов и нитритов [69]. Принцип метода заключается в одновременном восстановлении нитратов в нитриты в присутствии хлористого ванадия и реакции диазотирования с последующим развитием окраски, интенсивность которой определяли спектрофотометрически при длине волны 540 нм. Анализ 100 мкл депротеинизироваиной сыворотки проводили в 96 луночных планшетах с плоским дном. Чувствительность метода на приборе Labsystems Multiskan МСС/340 составляет 1,7 мкМ. Для колориметрического определения нитритиона использовали реактив Грисса, состоящий из равных частей раствора I (0,05% раствор N-нафтилэтилендиамина в воде) и раствора II (1% раствор сульфаниламида в 30% уксусной кислоте) [69]. Оба раствора хранятся в темноте при температуре 4°С в течение нескольких месяцев. Для приготов1 Биохимические исследования показателей Total NO и активности NOсинтазы проведены в соответствии с договором (предмет договора «Биохимическое определение маркёров функционального состояния эндотелия», № 15/12 от 27 декабря) о научно-техническом сотрудничестве между КГМУ и Государственным учреждением «Государственный Научноисследовательский центр профилактической медицины М3 РФ (ГНИЦ ИМ М3 РФ)», г. Москва на базе лаборатории под руководством профессора В А. Метельской, за что выражаем сотрудникам глубокую благодарность. 29 ления раствора хлористого ванадия 400 мг VCI3 растворяли в 50 мл IN HCI с последующим фильтрованием через бумажный фильтр. Всегда использовали свежеприготовленный раствор. Уровень метаболитов N0 (то есть суммарную концентрацию нитратов и нитритов, NOx) определяли колориметрическим методом по развитию окраски в реакции диазотирования нитритом сульфаниламида, входящего в состав реактива Грисса. Для построения калибровочной кривой использовали 1М раствор NaNCb в воде, который хранили при температуре -20°С; перед употреблением его разводили в 1000 раз и готовили серию разведений для построения кривой. Уровень экспрессии эндотелиальной синтазы оксида азота (e-NOS) определяли в клеточном лизате по методу R.J. Hendrickson [112] с небольшими модификациями. По окончании инкубации клеток с исследуемой сывороткой человека их трижды промывали 5 мМ фосфатным буфером, pH 7,4, клетки из одной лунки собирали в 100 мкл лизирующего буфера: 0,1 М ацетат Na, pH 6,8, содержащего 5 мМ ЭДТА и 3% додецилсульфат Na (SDS), центрифугировали 10 мин при 1000 х g и подвергали электрофорезу в полиакриламидном геле (ПААГ) в присутствии SDS, согласно методу [112]. В лунку наносили 20 мкг белка. На каждую пластину наносили смесь предварительно окрашенных белков-метчиков с диапазоном молекулярной массой (М.м.) 7000-200000 Да (Bio-Rad Kaleidoscope Prestained Standards, USA), что позволяло идентифицировать полосу, соответствующую eNOS (М.м. которой 140000 Да). Белок в клеточном лизате опредляли по методу Lowry с использованием БСА в качестве стандарта. По окончании электофореза осуществляли перенос белков с геля на нитроцеллюлозную мембрану Вестерн-блот (60 В, 1 час). Эффективность переноса определяли с помощью обратимого окрашивания мембран белковым красителем Ponceau Red (Sigma, USA). После трёхкратной отмывки мембраны 5 мМ фосфатным буфером, pi I 7,4, содержащим 150 мМ NaCl и 0,05% твина-200, её в течение ночи обрабатывали раствором поликлональ30 |