|
32 окраски в реакции диазотирования нитритом сульфаниламида, входящего в состав реактива Грисса. Для построения калибровочной кривой использовали 1М раствор NaN02 в воде, который хранили при температуре -20°С; перед употреблением его разводили в 1000 раз и готовили серию разведений для построения кривой. Уровень экспрессии эндотелиальной синтазы оксида азота (e-NOS) определяли в клеточном лизате по методу R.J. Hendrickson [111] с небольшими модификациями. По окончании инкубации клеток с исследуемой сывороткой человека их трижды промывали 5 мМ фосфатным буфером, pH 7,4, клетки из одной лунки собирали в 100 мкл лизирующего буфера: 0,1 М ацетат Na, pH 6,8, содержащего 5 мМ ЭДТА и 3% додецилсульфат Na (SOS), центрифугировали 10 мин при 1000 х g и подвергали электрофорезу в полиакриламидном геле (ПААГ) в присутствии SDS, согласно методу [111]. В лунку наносили 20 мкг белка. На каждую пластину наносили смесь предварительно окрашенных белков-метчиков с диапазоном молекулярной массой (М.м.) 7000-200000 Да (Bio-Rad Kaleidoscope Prestained Standards, USA), что позволяло идентифицировать полосу, соответствующую eNOS (М.м. которой 140000 Да). Белок в клеточном лизате определяли по методу Lowry с использованием БСА в качестве стандарта. По окончании электрофореза осуществляли перенос белков с геля на нитроцеллюлозную мембрану Вестерн-блог (60 В, 1 час). Эффективность переноса определяли с помощью обратимого окрашивания мембран белковым красителем Ponceau Red (Sigma, USA). После трёхкратной отмывки мембраны 5 мМ фосфатным буфером, pH 7,4, содержащим 150 мМ NaCl и 0,05% твина-200, её в течение ночи обрабатывали раствором поликлональных кроличьих антител против eNOS человека (BD Transduction Labs, USA), разведённых (в соотношении 1:500) в 5 мМ фосфатном буфере, pH 7,4, содержащем 0,1% азида натрия. Затем мембрану отмывали 7 раз но 10 мин в том же буфере. В течение часа мембрану инкубировали с |
ления раствора хлористого ванадия 400 мг VCI3 растворяли в 50 мл IN HCI с последующим фильтрованием через бумажный фильтр. Всегда использовали свежеприготовленный раствор. Уровень метаболитов N0 (то есть суммарную концентрацию нитратов и нитритов, NOx) определяли колориметрическим методом по развитию окраски в реакции диазотирования нитритом сульфаниламида, входящего в состав реактива Грисса. Для построения калибровочной кривой использовали 1М раствор NaNCb в воде, который хранили при температуре -20°С; перед употреблением его разводили в 1000 раз и готовили серию разведений для построения кривой. Уровень экспрессии эндотелиальной синтазы оксида азота (e-NOS) определяли в клеточном лизате по методу R.J. Hendrickson [112] с небольшими модификациями. По окончании инкубации клеток с исследуемой сывороткой человека их трижды промывали 5 мМ фосфатным буфером, pH 7,4, клетки из одной лунки собирали в 100 мкл лизирующего буфера: 0,1 М ацетат Na, pH 6,8, содержащего 5 мМ ЭДТА и 3% додецилсульфат Na (SDS), центрифугировали 10 мин при 1000 х g и подвергали электрофорезу в полиакриламидном геле (ПААГ) в присутствии SDS, согласно методу [112]. В лунку наносили 20 мкг белка. На каждую пластину наносили смесь предварительно окрашенных белков-метчиков с диапазоном молекулярной массой (М.м.) 7000-200000 Да (Bio-Rad Kaleidoscope Prestained Standards, USA), что позволяло идентифицировать полосу, соответствующую eNOS (М.м. которой 140000 Да). Белок в клеточном лизате опредляли по методу Lowry с использованием БСА в качестве стандарта. По окончании электофореза осуществляли перенос белков с геля на нитроцеллюлозную мембрану Вестерн-блот (60 В, 1 час). Эффективность переноса определяли с помощью обратимого окрашивания мембран белковым красителем Ponceau Red (Sigma, USA). После трёхкратной отмывки мембраны 5 мМ фосфатным буфером, pi I 7,4, содержащим 150 мМ NaCl и 0,05% твина-200, её в течение ночи обрабатывали раствором поликлональ30 ных кроличьих антител против eNOS человека (BD Transduction Labs, USA), разведённых (в соотношении 1:500) в 5 мМ фосфатном буфере, pH 7,4, содержащем 0,1% азида натрия. Затем мембрану отмывали 7 раз по 10 мин в том же буфере. В течение часа мембрану инкубировали с разведёнными в соотношении 1:300 вторыми антителами, конъюгированными с нероксидазой хрена (goat anti-rabbit IgG antibodies, Sigma, USA). При этом неспецифическое связывание конъюгатом блокировали добавлением в буфер 5% обезжиренного сухого молока. Затем мембрану снова отмывали в фосфатном буфере (7 раз по 10 мин). Детекцию полосы eNOS проводили методом усиленной хемолюминесценции (ECL). После отмывки в фосфатном буфере 7 раз по 10 мин мембрану обрабатывали соответствующим раствором (ECL, Amersham), как указано производителем, экспонировали на плёнку Hyperfilm-ECL (Amersham UK) в течение 2 ч в темноте. Полоску, соответствующую eNOS детектировали в соответствии с её молекулярной массой, устанавливаемой по сравнению с белками-метчиками. Плёнку высушивали на воздухе, полосы сканировали и рассчитывали площадь под кривой с использованием программы Total Lab. (рис. 2.1). .•у. ^______ eNOS, 140 kDa + + + ± ± Рисунок 2.1. Типичная авторадиофамма Вестсрн-блота, окрашенного оликлональными антителами против eNOS с последующей обработкой но методу ECL после его экспонирования с рентгеновской плёнкой «Hyperfilm» (Amersham). 31 |