|
(1960) в некоторых случаях до 80% органической фазы сапропелем может быть обусловлено сине-зелеными водорослями. В связи с этим источником антикоагулянтов мы избрали сапропель, как концентрат сине-зеленых водорослей. Рядом приемов, включающих экстракцию сапропеля дистиллированной водой, отстаивание экстракта, упаривание водной фракции и ее фильтрацию через полупроницаемую мембрану Т-100 и гельфильтрации, нами получена стандартная фракция сапропеля. Используя эту фракцию, мы разработали способ количественного определения антикоагулянтной активности в условных единицах активности (ЕА), что позволило устанавливать изменения удельного содержания ингибиторов в процессе выделения и контролировать их содержание в экспериментах т укго. При расшифровке механизма ограничения свертывающей активности плазмы крови прежде всего мы с помощью объективного способа (регистрация процесса свертывания плазмы в динамике коагулографом Н 334) убедились, что полученная нами высокоочищенная фракция сапропеля обладает выраженной антикоагулянтной активностью. При этом в качестве субстрата использовали пулированную донорскую плазму, а в качестве эффектора фракцию сапропеля, содержащую 100 ЕА/мл. При такой концентрации эффектора время, затраченное на формирование сгустка фибрина, возросло на 8,3% при увеличении общей продолжительности свертывания на 64,3%, а время от момента инициации свертывания до начала формирования фибринового сгустка соотносится в опыте и контроле как 6:1. Возрастание времени, затрачиваемого на формирование фибрина может свидетельствовать об определенном влиянии эффектора на этот процесс. Такое предположение требует исключения или подтверждения проявления гепариноподобной активности изучаемого носителя, т.к. из широко 112 |
■ 273 дэ /1960/ в некоторых случаях до 80% органической фазы сапропелей может быть обусловлено сине-зелеными водорослями. В связи с этим предполагаемым источником антикоагулянтов мы избрали сапропель, как концентрат сине-зеленых водорослей. Прежде всего, основываясь на ранее разработанных принципах выделения антикоагулянтов из растений, мы получили стандартную фракцию сапропеля, обладающую антикоагулянтной активностью. Используя эту фракцию, мы разработали способ количественного определения антикоагулянтной активности в условных единицах активности (ЕА, как это показано в разделе 4.1.)* что позволило устанавливать изменения удельного содержания ингибиторов в процессе выделения и контролировать их содержание в экспериментах. Разработку оптимального способа получения фракции сапропеля, обладающей антикоагулянтной активностью, существенно облегчило то, что мы ориентировались, по аналогии с растительными антикоагулянтами, на пептидную природу носителя, а также то, что регистрацию ингибитора проводили с помощью специфической реакции по влиянию получаемых фракций на скорость превращения фибриногена в фибрин под действием тромбина т ч\\то в стандартных условиях. Прежде всего мы определились с экстрагентом. Используя з качестве экстрагента наиболее распространенные растворители, такие как дистиллированная вода, 0,1М водный раствор аммиака, 0,1М раствор едкого натра, 40% этанол и 0,1М раствор уксусной кислоты, пришли к заключению, что при такой постановке эксперимента наиболее эффективным экстрагентом является 0,1М водный раствор аммиака. Экстракция сапропеля растворами аммиака в концентрациях от 0,05 до 0,ЗМ показала, что оптимальной слу 276 нательном количестве содержащиеся в сапропеле. Рядом приемов, подробно описанных а разделе «Собственные исследования», мы подтвердили, что получаемая активная фракция сапропеля наряду с носителем антикоагулянтной активности пептидом, в качестве постоянно присутствующей примеси содержит комплекс гуминовых кислот. I Мы нашли способ отделения пептидной части фракции от гуминовых кислот, заключающийся в высаливании кислот сульфатом аммония при конечной 100% его концентрации, замещении сульфата аммония этанолом с последующей его отгонкой. Таким образом получали раствор антикоагулянтов, полностью освобожденных от примесей. Заключительным приемом очистки явилась гель-фильтрация на гелях ЗерЬабех с различным пределом исключения. Элюатом служил 0,05М аммонийно-ацетатный буферный раствор с рН 7,6. Наилучший эффект был достигнут при использовании геля 8ерЬабех 0-50. хотя он и сопровождался 40%-й потерей антикоагулянтной активности. В то же время при гельфильтрации в вышеуказанных условиях антикоагулянтная активность элюировалась в ^иде двух отдельных пиков, свидетельствующих о присутствии в полученной фракции минимум двух индивидуальных носителей й 12), отличных по молекулярной массе. При расшифровке механизма ограничения свертывающей активности плазмы крови прежде всего мы с помощью объективного способа (регистрация процесса свертывания плазмы в динамике коагулографом Н 334) убедились, что полученные нами фракции сапропеля обладают выраженной антикоагулянтной активностью. При этом в качестве субстрата использовали пулированную донорскую плазму, а в качестве эффекторов II и 12 совместно и по |