|
то эта же эффективность торможения реакции взаимодействия тромбина с фибриногеном достигается 71% концентрации тех же эффекторов. Торможение аутополимеризации требует еще меньшие концентрации около 30%. Это свидетельствует об однотипности действия эффекторов I и II на процесс плазмокоагуляции и о наибольшей чувствительности к ним процесса коагуляционного превращения фибриногена. Далее мы более подробно изучили влияние эффекторов I и II на свертывание крови. Для этого сначала исследовали процесс свертывания плазмы крови в присутствии эффекторов равной степени активности с помощью электрокоагулографа, что позволило получить общее представление о процессе свертывания от момента его инициации и до ретракции и фибринолиза в цифровом выражении. Уже на этом этапе исследований стало ясно, что влияние изучаемых эффекторов на свертывание крови различно. Эффектор I почти по всем определяемым показателям оказался активнее эффектора II. Так, эффектор I увеличивает латентный период до начала свертывания в 2 раза, эффектор II его не изменяет. Эффектор I в 4,5 раза увеличивает продолжительность свертывания (эффектор II только в 1,4 раза). Эффектор I в 4 раза снижает скорость свертывания (эффектор II в 1,2 раза). Различие во влиянии на свертывание подтверждается и коагулограммой, записанной в присутствии суммы эффекторов I и И: она существенно отличается от предыдущих электрокоагулограмм. Выше мы показали, что чем архитектурно сложнее тест свертывания, тем больше требуется эффектора для достижения одной и той же эффективности торможения. Следовательно, не исключена возможность действия эффекторов на этапах, предшествующих коагуляционному превращению фибриногена, на которых происходит потребление части эффекторов. В противном случае их концентрации в различных 118 |
-105Это свидетельствует об однотипности действия эффекторов I и II на процесс плазмокоагуляции и о наибольшей чувствительности к ним процесса коагуляционного превращения фибриногена. Процесс коагуляционного превращения фибриногена включает ферментативный этап взаимодействие тромбина с фибриногеном, в результате чего от фибриногена отщепляются фибринопептиды А и В и образуется мономерный фибрин с обнаженными центрами связывания (центры О и Е). В свою очередь мономерный фибрин спонтанно полимеризуется сначала с образованием олигомеров и протофибрилл, затем наступает процесс латеральной агрегации, сопровождающийся формированием регулярной трехмерной сети фибрина /Бышевский А.III. и соавт., 1987/. Расшифровка влияния исследуемых эффекторов на процесс коагуляционного превращения фибриногена показала (для этого мы поставили эксперимент, в котором эффекторы вносили в разные моменты времени от начала реакции взаимодействия тромбина с фибриногеном, что позволяло проследить их влияние на различные этапы процесса), что оба эффектора преимущественно ограничивают накопление олигомеров, в меньшей степени протофибрилл, и не влияют на агрегацию протофибрилл. Это было подтверждено экспериментом, проведенным по методу В.А. Белицера (метод тестирования стадий), использумому для изучения эффекторов самосброрки фибрина /Белицер В.А., Варецкая Т.В., 1975/. Проведенный нами анализ свидетельствует о неодинаковой чувствительности к эффекторам разных этапов процесса самосборки, а полученные данные с полной определенностью свидетельствуют, что наиболее восприимчивы к действию эффекторов мономеры фибрина и его олигомеры. По мере созревания протофибрилл ингибирующий эффект снижается и по истечении 62% времени, необходимого для завершения образования фибрина, действие 106димого для завершения образования фибрина, действие эффекторов на процесс самосборки прекращается. Поскольку ведущую роль в формировании фибрина играют электростатические взаимодействия, мы допустили, что и эффекторы с мономерами связываются посредством электростатических связей. Это предположение в полной мере подтвердилось при изучении характера влияния эффекторов на самосборку в зависимости от величины ионной силы и рН среды, в которой происходит процесс: налицо увеличение эффективности торможения по мере повышения ионной силы. То же происходит при изменении значений рН в среде самосборки (особенно в пределах от 7,0 до 9,0). Из этого следует, что эффекторы служат донорами отрицательно заряженных функциональных групп для образования связи с мономерным фибрином. По всей видимости, эффекторы не взаимодействуют с активными центрами мономеров, но образуя связи с кластерами положительных зарядов, расположенных на поверхности молекулы мономера помимо центров связывания фибрин-фибрин, создают стерические препятствия на пути формирования фибрина. Об этом говорит тот факт, что эффекторы способны связываться как с нативным фибриногеном, имеющим открытые Е-центры связывания, так и с фибрином, уже не имеющим свободных активных центров. Далее мы более подробно изучили влияние эффекторов I и II на свертывание крови. Для этого сначала исследовали процесс свертывания плазмы крови в присутствии эффекторов равной степени активности с помощью электрокоагулографа, что позволило получить общее представление о процессе свертывания от момента его инициации и до ретракции и фибринолиза в цифровом выражении. 107Уже на этом этапе исследований стало ясно, что влияние изучаемых эффекторов на свертывание крови различно. Эффектор I почти по всем определяемым показателям оказался активнее эффектора II. Так, эффектор I увеличивает латентный период до начала свертывания в 2 раза, эффектор II его не изменяет. Эффектор I в 4,5 раза увеличивает продолжительность свертывания (эффектор II только в 1,4 раза). Эффектор I в 4 раза снижает скорость свертывания (эффектор II в 1,2 раза). Различие во влиянии на свертывание подтверждается и коагулограммой, записанной в присутствии суммы эффекторов I и И: она существенно отличается от предыдущих электрокоагулограмм, полученных при использовании эффекторов I и II порознь. Выше мы показали, что чем архитектурно сложнее тест свертывания, тем больше требуется эффектора для достижения одной и той же эффективности торможения. Следовательно, не исключена возможность действия эффекторов на этапах, предшествующих коагуляционному превращению фибриногена, на которых происходит потребление части эффекторов. В противном случае их концентрации в различных тестах были бы равны, или, по крайней мере, сопоставимы. Это сомнение усиливается тем, что, до данным электрокоагулограммы, эффектор I удлиняет период до начала формирования фибринового сгустка. Для разрешения данного вопроса мы разработали методику, позволяющую вычленить из общего каскада реакций свертывания процесс коагуляционного превращения фибриногена. Суть этой методики заключается в том, что пулированную донорскую плазму освобождают от фибриногена путем мягкой тепловой денатурации (56°С, 3 мин). Если к такой дефибринированной плазме прибавить фибриноген, эффекторы и затем провоцировать процесс свертывания, то эффекторы могут влиять на любой из этапов плазмокоагу |