|
для интерпретации данных в экспериментах по оценке влияния эффекторов на процесс агрегации тромбоцитов. Рисунок 2. График зависимости содержания эффекторов (ЕА) во фракциях сапропеля от эффективности торможения (построен на основе данных, представленных на рис. 2). Абсцисса количество ЕА в пробе; ордината эффективность торможения (1). Далее мы попытались определить основные методические приемы, с помощью которых можно максимально очистить эффекторы. Следует отметить, что ранее применяевшаяся схема выделения фракции сапропеля с антикоагулянтной активностью /Чирятьев Е.А. и соавт., 1998/ уже подразумевает частичную очистку носителя. Так, в процессе ультрафильтрации через полупроницаемую мембрану Т-100, фракции освобождаются от низкомолекулярных компонентов, а после концентрирования и центрифугирования осаждаются мелкодисперсные частицы. К сожалению, оценить степень очистки носителя на этом этапе выделения не представляется возможным, поскольку концентрат до диализа содержит большое количество солей, не позволяющих провести его тестирование. 53 |
185ный график использовали для оценки содержания антикоагулянта во фракциях экстракта сапропеля при разработке оптимального способа выделения антикоагулянта при изменении параметров операции, при оценке степени его очистки, установлении природы ингибитора, изучении механизма ограничения плазмокоагуляции, а также для интерпретации данных в экспериментах по предварительной оценке влияния фракций сапропеля на свертывающую активность крови. Для пересчета концентрации антикоагулянта на 1 кг сапропеля количество ЕА умножали на 20. Рисунок 33. График зависимости содержания ингибитора (ЕА) во фракциях сапропеля от эффективности торможения (построен на основе данных, представленных на рис. 32). Абсцисса количество ЕА в пробе; ордината эффективность торможения (0. 4.3.1. Разработка способа получения фракции сапропеля с антикоагулянтной активностью. Прежде всего мы выбирали наиболее подходящий экстрагент. Для этого использовали дистиллированную воду, 0,1 М раствор аммиака, 0,1 М раствор едкого натра, 40% этанол и 0,1 М раствор уксусной кислоты. Все операции по выделению антикоагулянтной 188тановили, что оптимальный температурный режим экстракции составляет 20°С (285 600 ЕА/кг): выход антикоагулянта в 1,83 и 1,62 раза выше, чем при температуре 5 и 60°С соответственно. Последним опытом в этой серии экспериментов был выбор количественного соотношения сырье:экстрагент при соблюдении выше указанных параметров экстракции (0,1 М раствор аммиака, 60 мин, 20°С). Оказалось, что при соотношениях сырье:экстрагент 1:3, 1:5 и 1:7 антикоагулянт экстрагируется примерно в равных количествах 289 000*113 ЕА/кг. Увеличение количества экстрагента влечет за собой существенное увеличение времени, затрачиваемого на остальные операции по выделению ингибитора (почти в 4 раза) удлиняются время диализа и упаривания на ротационном испарителе. Следовательно, оптимальным соотношением сырьс:экстрагент является соотношение 1:3. Таким образом, вышеприведенные эксперименты позволяют считать, что наиболее приемлемыми являются следующие параметры экстракции: соотношение сырье:экстрагент 1:3, температура экстракции 20°С, время экстракции 60 мин при использовании в качестве экстрагента 0,1 М водного раствора аммиака. 4.3.2.Разработка приемов очистки ингибиторов из сапропеля. В этом разделе исследований мы попытались определить основные методические приемы, с помощью которых можно добиться поставленной цели. Следует отметить, что предлагаемая нами схема выделения фракции сапропеля уже подразумевает частичную очистку носителя. Так, в процессе ультрафильтрации через полупроницаемую мембрану Т-100, фракции освобождаются от низкомолекулярных компонентов, а после концентрирования и центрифугирования 189осаждаются мелкодисперсные частицы. К сожалению, оценить степень очистки на этом этапе выделения антикоагулянта не представляется возможным, поскольку концентрат до диализа содержит большое количество солей, не позволяющих провести его тестирование. Априори предположив, что окраска получаемого нами концентрата экстракта определяется, в основном, содержащимися в нем примесями, при косвенной оценке степени очистки мы ориентировались на два показателя: оптическую плотность растворов фракций различной степени очистки и количество единиц активности ингибитора, содержащихся в этих фракциях. Такой подход оправдался: при гель-фильтрации фракции экстракта, полученной по схеме, указанной выше, через колонку, заполненную гелем сефадекса С-150 (колонка 20x500 мм, элюент 0,05 М аммонийно-ацетатный буфер с рН 7,6, объем фракций 2 мл, внешний объем колонки по декстрану синему 13 мл) ингибиторная активность не совпадает с пиком оптической плотности (КФК-3, 465 нм) (рис. 34). Из этого эксперимента стало ясно, что гель-фильтрация на Сефадексе может явиться эффективным способом очистки носителей антикоагулянтной активности. Однако, мы попытались найти приемы, позволяющие максимально очистить носитель до гельфильтрации, что позволило бы эффективнее использовать вышеуказанный метод. С этой целью исходную фракцию экстракта подвергали различным воздействиям, таким как обработка при высоких температурах, обработка органическими растворителями с различной степенью гидрофобиости, осаждение примесей солями тяжелых металлов, связывание с фибрином и последующая диссоциация комплекса и др. Все вышеуказанные операции сопровождались изме |