|
Априори предположив, что окраска получаемого нами концентрата экстракта определяется в основном содержащимися в нем примесями, при оценке степени очистки мы ориентировались на два показателя: оптическую плотность растворов фракций и количество единиц активности ингибитора, содержащихся в этих фракциях. Такой подход оправдался: при гель-фильтрации фракции экстракта, полученной по схеме, включающей экстракцию 1 кг нативного сапропеля 0,1 М раствором аммиака при комнатной температуре (соотношение сырье:экстрагент 1:3, время экстракции 1 ч), отстаивание полученного экстракта в течение 24 ч и декантацию надосадка /Чирятьев Е.А. и соавт., 1998/, через колонку, заполненную гелем сефадекса С-150 (колонка 20x500 мм, элюент 0,05 М аммонийноацетатный буфер с рН 7,6, объем фракций 2 мл, внешний объем колонки по дскстрану синему 13 мл) ингибиторная активность не совпадает с пиком оптической плотности (КФК-3,465 нм) (рис. 3). Из этого эксперимента стало ясно, что гель-фильтрация на сефадексе может явиться эффективным способом очистки носителей антикоагулянтной активности. Однако, мы попытались найти приемы, позволяющие максимально очистить эффектор до гель-фильтрации, что позволило бы эффективнее использовать вышеуказанный метод. С этой целью исходную фракцию экстракта подвергали различным воздействиям, таким как обработка при высоких температурах, обработка органическими растворителями с различной степенью гидрофобности, осаждение примесей солями тяжелых металлов, связывание с фибрином и последующая диссоциация комплекса и др. Все вышеуказанные операции сопровождались изменениями значений рН и ионной силы. Однако достигнуть позитивного результата не удалось: очистки либо не происходило, либо ингибиторная активность резко 54 снижалась или исчезала совсем. |
189осаждаются мелкодисперсные частицы. К сожалению, оценить степень очистки на этом этапе выделения антикоагулянта не представляется возможным, поскольку концентрат до диализа содержит большое количество солей, не позволяющих провести его тестирование. Априори предположив, что окраска получаемого нами концентрата экстракта определяется, в основном, содержащимися в нем примесями, при косвенной оценке степени очистки мы ориентировались на два показателя: оптическую плотность растворов фракций различной степени очистки и количество единиц активности ингибитора, содержащихся в этих фракциях. Такой подход оправдался: при гель-фильтрации фракции экстракта, полученной по схеме, указанной выше, через колонку, заполненную гелем сефадекса С-150 (колонка 20x500 мм, элюент 0,05 М аммонийно-ацетатный буфер с рН 7,6, объем фракций 2 мл, внешний объем колонки по декстрану синему 13 мл) ингибиторная активность не совпадает с пиком оптической плотности (КФК-3, 465 нм) (рис. 34). Из этого эксперимента стало ясно, что гель-фильтрация на Сефадексе может явиться эффективным способом очистки носителей антикоагулянтной активности. Однако, мы попытались найти приемы, позволяющие максимально очистить носитель до гельфильтрации, что позволило бы эффективнее использовать вышеуказанный метод. С этой целью исходную фракцию экстракта подвергали различным воздействиям, таким как обработка при высоких температурах, обработка органическими растворителями с различной степенью гидрофобиости, осаждение примесей солями тяжелых металлов, связывание с фибрином и последующая диссоциация комплекса и др. Все вышеуказанные операции сопровождались изме * 190нениями значений рН и ионной силы. Однако достигнуть позитивного результата не удалось: очистки либо не происходило, либо ингибиторная активность резко снижалась или исчезала совсем. Рисунок 34. Хроматографический профиль эффективности торможения (1) и оптической плотности (2) элюата при хроматографии фракции экстракта на геле сефадекса 0-150. Абсцисса номер фракций, ордината слева эффективность торможения (О, справа оптическая плотность (13). Заслуживающим внимания приемом оказалось глубокое (при 20°С) и длительное (24 ч) замораживание фракции экстракта с последующим быстрым размораживанием при комнатной температуре. При этом выпадает обильный осадок, легко удаляемый при центрифугировании при 3 ООО Мы определили основные параметры этой операции (температура и время замораживания). Порции экстракта подвергали замораживанию в холодильной камере в течение 6 ч при различных значениях температур. После размораживания центрифугировали, определяли количество ЕА |