|
Таблица 2 Количество эффекторов во фракциях сапропеля и их оптическая плотность при замораживании при -20°С в течение различного времени Время, в течение которого производилось замораживание, ч Количество ЕА/мл Оптическая плотность до замораживания 20,25±2,0 0,129 ±0,007 1 20,02±2,2 0,103 ±0,004 3 19,94±1,9 0,092 ±0,006 6 19,89+0,8 0,086 ±0,003 12 19,86±0,6 0,081 ±0,004 18 19,83±1,5 0,074 ±0,003 24 19,82±2,1 0,067 ± 0,005 30 19,82±2,0 0,067 ±0,002 Следующим приемом выделения носителей антикоагулянтной активности мы избрали гель-фильтрацию на геле сефадекс. С этой целью были опробованы гели с различным пределом исключения: С-15, С-25, С-50, С-100, С-150 и С-200. При использовании первых двух, фракции с антикоагулянтной активностью обнаруживались во внешнем объеме колонки совместно с пиком оптической плотности, т.е. очистки практически не происходило. Применение же гелей С-50, 0150 или С-200 привело (как это показано ранее) к разделению пиков антикоагулянтной активности и оптической плотности (рис. 3). Судя по изменению оптической плотности (мы предположили, что по мере повышения степени очистки эффекторов оптическая плотность его раствора при 0465 стремится к нулю), степень очистки пиковой фракции по сравнению с исходным экстрактом достигла ПО. Повторная рехрогматография сконцентрированных активных фракций дополнительной очистки не принесла. Одновременно, хроматография на колонке с гелем 0-150 в вышеуказанных условиях сопровождается существенной потерей актив57 |
192эксперимента снижается почти на 50%. Следовательно, оптимальное время, в течение которого осуществляется замораживание, составляет 24 ч. Таблица 38 Количество антикоагулянта во фракциях сапропеля и их оптическая плотность при замораживании при -20°С в течение различного времени__________ ____________________ ____________________ Время, в течение которого производилось замораживание, ч Количество НА /мл Оптическая плотность до замораживания 20,25±2,0 0,129 ± 0,007 1 20,02±2,2 0,103 ±0,004 3 19,94± 1,9 0,092 ± 0,006 б 19,89±0,8 0,086 ± 0,003 12 19,86±0,6 0,081 ± 0,004 18 19,83±1,5 0,074 ± 0,003 24 19,82±2,1 0,067 ± 0,005 30 19,82±2,0 0,067 ± 0.002 Следующим приемом выделения антикоагулянта мы избрали гель-фильтрацию на геле Сефадекс. С этой целью были опробованы гели с различным пределом исключения: С-50, С-100, С-150 и С-200. При использовании первых двух, фракции с антикоагулянтной активностью обнаруживались во внешнем объеме колонки совместно с пиком оптической плотности, т.е. очистки практически не происходило. Применение же гелей С-150 или С-200 привело (как это показано ранее) к разделению пиков антикоагулянтной активности и оптической плотности (рис. 34). Судя по изменению оптической плотности (мы предположили, что по мере повышения степени очистки антикоагулянта оптическая плотность его раствора при стремится к нулю), степень очистки пиковой фракции по сравнению с исходным экстрактом 193 достигла 110. Повторная рехроматография сконцентрированных активных фракций дополнительной очистки не принесла. Одновременно, хроматография на колонке с гелем 0-150 в вышеуказанных условиях сопровождается существенной потерей антикоагулянта. Так, при внесении в колонку 793 ЕА, в элюате обнаруживается только 480 ЕА, т.е. потери составляют 40,7 %. Степень же очистки при объединении всех активных фракций элюата достигает 4-х. Это указывает на то, что пептид носитель антикоагулянтной активности во фракции экстракта находится в виде достаточно прочного комплекса с каким либо другим соединением. Анализ данных литературы показал, что в этом плане наибо лее подходящей кандидатурой являются гуминовые кислоты в значительном количестве содержащиеся в сапропеле. Об этом свидетельствует следующее. 1. Гуминовые кислоты достаточно хорошо растворимы в воде и, особенно, в щелочном растворе. Следовательно, они хорошо экстрагируются 0,1 М раствором аммиака. 2. Изоэлектрическая точка гуминовых кислот находится в пределах рН от 1,0 до 1,5, что обусловливает их высокий общий отрицательный заряд и выраженную способность к электростатическим взаимодействиям с другими компонентами смеси. 3. Молекулы гуминовых кислот отличаются гетерогенностью, а их молекулярная масса составляет от 50 до 10 ООО кДа. Этим, а также изложенным в п. 2, объясняется неэффективность использования гелей сефадексов для отделения гуминовых кислот от носителей антикоагулянтной активности. Мы определили абсорбционный спектр очищенной фракции сапропеля в зоне длин волн от 200 до 320 нм с помощью спектро |