|
поста. Так, при внесении в колонку 793 ЕА эффектора, в элюате обнаруживается только 480 ЕА, т.е. потери составляют 40,7 %. Степень же очистки при объединении всех активных фракций элюата достигает 4х. Это указывает на то, что носитель антикоагулянтной активности во фракции экстракта находится в виде достаточно прочного комплекса с каким либо другим соединением. Анализ данных литературы /Комиссаров И.Д. и соавт., 1971/показал, что в этом плане наиболее подходящей кандидатурой являются гуминовые кислоты в значительном количестве содержащиеся в сапропеле. Об этом свидетельствует следующее. 1. Гуминовые кислоты достаточно хорошо растворимы в воде и, особенно, в щелочном растворе. Следовательно, они хорошо экстрагируются 0,1 М раствором аммиака. 2. Изоэлектрическая точка гуминовых кислот находится в пределах рН от 1,0 до 1,5, что обусловливает их высокий общий отрицательный заряд и выраженную способность к электростатическим взаимодействиям с другими компонентами смеси. 3. Молекулы гуминовых кислот отличаются гетерогенностью, а их молекулярная масса составляет от 50 до 10 000 кДа. Этим, а также изложенным в п. 2, объясняется неэффективность использования гелей сефадексов для отделения гуминовых кислот от носителей антикоагулянтной активности. Мы определили абсорбционный спектр очищенной фракции сапропеля в зоне длин волн от 200 до 320 нм с помощью спектрофотометра СФ-46 он характеризуется сплошным поглощением, возрастающим в коротковолновой части спектра (рис. 4). Данные литературы свидетельствуют, что изолированные ^миновые кислоты имеют спектр поглощения, идентичный полученному нами /Стрельцова И.Н. и соавт., 1971/. Учитывая их фактическую молекулярную массу и то, что носителями специфических свойств гуми58 |
193 достигла 110. Повторная рехроматография сконцентрированных активных фракций дополнительной очистки не принесла. Одновременно, хроматография на колонке с гелем 0-150 в вышеуказанных условиях сопровождается существенной потерей антикоагулянта. Так, при внесении в колонку 793 ЕА, в элюате обнаруживается только 480 ЕА, т.е. потери составляют 40,7 %. Степень же очистки при объединении всех активных фракций элюата достигает 4-х. Это указывает на то, что пептид носитель антикоагулянтной активности во фракции экстракта находится в виде достаточно прочного комплекса с каким либо другим соединением. Анализ данных литературы показал, что в этом плане наибо лее подходящей кандидатурой являются гуминовые кислоты в значительном количестве содержащиеся в сапропеле. Об этом свидетельствует следующее. 1. Гуминовые кислоты достаточно хорошо растворимы в воде и, особенно, в щелочном растворе. Следовательно, они хорошо экстрагируются 0,1 М раствором аммиака. 2. Изоэлектрическая точка гуминовых кислот находится в пределах рН от 1,0 до 1,5, что обусловливает их высокий общий отрицательный заряд и выраженную способность к электростатическим взаимодействиям с другими компонентами смеси. 3. Молекулы гуминовых кислот отличаются гетерогенностью, а их молекулярная масса составляет от 50 до 10 ООО кДа. Этим, а также изложенным в п. 2, объясняется неэффективность использования гелей сефадексов для отделения гуминовых кислот от носителей антикоагулянтной активности. Мы определили абсорбционный спектр очищенной фракции сапропеля в зоне длин волн от 200 до 320 нм с помощью спектро • 1 9 4 фотометра СФ-46 он характеризуется сплошным поглощением, возрастающим в коротковолновой части спектра (рис. 35). 200 215 230 250 270 290 310 Рисунок 35. Абсорбционный спектр фракции экстракта, содержащей носитель антикоагулянтной активности, полученной после гель-фильтрации на сефадексе С-150. Абсцисса длина волны (Я), ордината оптическая плотность (О. Данные литературы свидетельствуют, что изолированные гуминовые кислоты имеют спектр поглощения, идентичный полученному нами. Учитывая их фактическую молекулярную массу и тот факт, что носителями специфических свойств гуминовых кислот являются конденсированные ароматические ядра, соединенные друг с другом через цепи, имеющие достаточное сопряжение углсрод-углеродиых связей, обеспечивающих свободное движение делокализованных электронов в пределах всей макромолекулы, мы получили спектр поглощения не носителя ингибиторной активности, а спектр гуминовых кислот, маскирующий носитель. Известно, что изоэлектрическая точка гуминовых кислот находится в пределах значений рН от 1,0 до 1,5. Основываясь на этом фракцию экстракта подкисляли хлористоводородной кислотой до рН 1,0 при нагревании на кипящей водяной бане в течение 5 275 гированием, а антикоагулянтная активность фракции практически не изменяется. Далее мы уточнили оптимальные параметры этой операции, замораживая фракции при температурах от -10 до -25°С в течении от 1 до 30 ч и показали, что замораживание должно производиться при -20°С 24 ч. Хроматография на бумаге этой фракции указала на наличие как минимум двух различных веществ; одно из них достаточно четко локализовано и окрашивается нингидриновым реактивом, другое размытое и флуоресцирует голубовато-желтым цветом. Установлено, что антикоагулянтная активность сосредоточена в области нингидринположительного пятна. Это укрепило нас во мнении, что носитель имеет К-концевые аминокислоты, т.е. относится к группе пептидов. Окончательным подтверждением этому явились эксперименты, в которых изолированный носитель антикоагулянтной активности, полученный после хроматографии на бумаге, подвергали кислотному и ферментативному гидролизу в условиях, оптимальных для этих операций. В результате после кислотного гидролиза мы наблюдали полное отсутствие антикоагулянтного эффекта, причем носитель (по данным хроматографии на бумаге) распадался на ряд аминокислот. Ферментативный гидролиз также приводил к изменению исходной антикоагулянтной активности: последовательный трипсиново-папаиновый полностью инактивировал ингибитор, папаиновый на 65%, а трипсиновый на 6,5%. Следовательно носитель антикоагулянтной активности пептид в получаемых нами фракциях экстракта находится в виде достаточно прочного комплекса с каким либо другим соединением. Анализ данных литературы показал, что в этом плане наиболее подходящей кандидатурой являются гуминовые кислоты в зна |