|
новых кислот являются конденсированные ароматические ядра, соединенные друг с другом через цепи, имеющие достаточное сопряжение углерод-углеродных связей и обеспечивающих свободное движение делокализованных электронов в пределах всей макромолекулы, мы получили (рис. 4) спектр поглощения не носителя ингибиторной активности, а спектр гуминовых кислот, маскирующий носитель. Рисунок 4. Абсорбционный спектр фракции экстракта, содержащей носитель антикоагулянтной активности, полученной после гельфильтрации на сефадексе 0-150. Абсцисса длина волны (А,), ордината оптическая плотность (Э). Известно, что изоэлектрическая точка гуминовых кислот находится в пределах значений рН от 1,0 до 1,5. Основываясь на этом фракцию экстракта подкисляли хлористоводородной кислотой до рН 1,0 при нагревании на кипящей водяной бане в течение 5 мин. При этом наблюдали выпадение хлопьевидного осадка. Осадок удаляли центрифугированием, а супернатант освобождали от кислоты под вакуумом с помощью ротационного испарителя. После приведения к рН, равному 7,6, ингибиторной активности в супернатанте не обнаруживалось. Следовательно, можно предположить, что носители антикоагулянтной активности соосаждаются в комплексе с гуминовыми кисло59 |
• 1 9 4 фотометра СФ-46 он характеризуется сплошным поглощением, возрастающим в коротковолновой части спектра (рис. 35). 200 215 230 250 270 290 310 Рисунок 35. Абсорбционный спектр фракции экстракта, содержащей носитель антикоагулянтной активности, полученной после гель-фильтрации на сефадексе С-150. Абсцисса длина волны (Я), ордината оптическая плотность (О. Данные литературы свидетельствуют, что изолированные гуминовые кислоты имеют спектр поглощения, идентичный полученному нами. Учитывая их фактическую молекулярную массу и тот факт, что носителями специфических свойств гуминовых кислот являются конденсированные ароматические ядра, соединенные друг с другом через цепи, имеющие достаточное сопряжение углсрод-углеродиых связей, обеспечивающих свободное движение делокализованных электронов в пределах всей макромолекулы, мы получили спектр поглощения не носителя ингибиторной активности, а спектр гуминовых кислот, маскирующий носитель. Известно, что изоэлектрическая точка гуминовых кислот находится в пределах значений рН от 1,0 до 1,5. Основываясь на этом фракцию экстракта подкисляли хлористоводородной кислотой до рН 1,0 при нагревании на кипящей водяной бане в течение 5 195еле приведения пернатанте не мин. При этом наблюдали выпадение хлопьевидного осадка. Осадок удаляли центрифугированием, а супернатант освобождали от кислоты под вакуумом с помощью ротационного испарителя. Пок рН, равному 7,6, ингибиторной активности в суобнаруживалось. Следовательно, можно предположить, что носитель антикоагулянтной активности соосаждается в комплексе с гуминовыми кислотами. В то же время осадок, растворенный в исходном объеме, на 75,6 % от первоначального, сохранял ингибиторную активность. Попытка отделения гуминовых кислот от носителя путем гель-хроматографии на колонке с ЭЕАЕ сефадексом А 25 очищенной фракции в ступенчатом градиенте рН, ионной силы и их комбинации (в качестве элюента использовали боратный буфер с ионной силой от 0,1 до 1,0, создаваемой хлоридом натрия, и значениями рН от 5,0 до 9,0), оказалась полностью не эффективной: ни ингибитор, ни гуминовые кислоты, даже в достаточно жестких условиях, с колонки не элюируются. По-видимому, гуминовые кислоты, обладая выраженным электрическим зарядом, чрезвычайно прочно связываются с анионообменником, удерживая одновременно и ингибитор. Аналогичный эксперимент, в котором вместо анионообменника использовали катионит (СМ сефадекс А 25), также не привел к желаемым результатам. Доказательством того, что носитель ингибиторной активности комплексируется с гуминовыми кислотами, послужил эксперимент, в котором через колонку, заполненную гелем сефадекс 0150 фильтровали изолированные гуминовые кислоты и высокоочищенную фракцию сапропеля, содержащую антикоагулянт (элю—ент 0,075 М аммонийно-ацетатный буферный раствор, колонка 15x320 мм, внешний объем 16 мл, объем фракций 2 мл): хрома |