|
тами. В то же время осадок, растворенный в исходном объеме, на 75,6 % от первоначального, сохранял ингибиторную активность. Попытка отделения гуминовых кислот от носителей путем гельхроматографии на колонке с ПЕЛЕ сефадексом А 25 очищенной фракции в ступенчатом градиенте рН, ионной силы и их комбинации (в качестве элюеита использовали боратный буфер с ионной силой от 0,1 до 1,0, создаваемой хлоридом натрия, и значениями рН от 5,0 до 9,0), оказалась полностью не эффективной: ни эффекторы, ни гуминовые кислоты, даже в достаточно жестких условиях, с колонки не элюируются. По-видимому, гуминовые кислоты, обладая выраженным электрическим зарядом, чрезвычайно прочно связываются с анионообменником, удерживая одновременно и эффекторы. Аналогичный эксперимент, в котором вместо анионообменника использовали катионит (СМ сефадекс А 25), также не привел к желаемым результатам. Доказательством того, что носители ингибиторной активности комплексируется с гуминовыми кислотами, послужил эксперимент, в котором через колонку, заполненную гелем сефадекс С-150, фильтровали изолированные гуминовые кислоты и высокоочишенную фракцию сапропеля, содержащую эффектор (элюент 0,075 М аммонийноацетатный буферный раствор, колонка 15x320 мм, внешний объем 16 мл, объем фракций 2 мл): хроматографические профили при гельфильтрации гуминовых кислот (по данным спектрофотометрии) и фракции сапропеля совпадают между собой. Итак, приведенные выше эксперименты убеждают, что полученная нами фракция сапропеля с антикоагулянтной активностью в своем составе имеет два основных компонента гуминовые кислоты и носители, обеспечивающие ингибирование плазмокоагуляции. 60 |
195еле приведения пернатанте не мин. При этом наблюдали выпадение хлопьевидного осадка. Осадок удаляли центрифугированием, а супернатант освобождали от кислоты под вакуумом с помощью ротационного испарителя. Пок рН, равному 7,6, ингибиторной активности в суобнаруживалось. Следовательно, можно предположить, что носитель антикоагулянтной активности соосаждается в комплексе с гуминовыми кислотами. В то же время осадок, растворенный в исходном объеме, на 75,6 % от первоначального, сохранял ингибиторную активность. Попытка отделения гуминовых кислот от носителя путем гель-хроматографии на колонке с ЭЕАЕ сефадексом А 25 очищенной фракции в ступенчатом градиенте рН, ионной силы и их комбинации (в качестве элюента использовали боратный буфер с ионной силой от 0,1 до 1,0, создаваемой хлоридом натрия, и значениями рН от 5,0 до 9,0), оказалась полностью не эффективной: ни ингибитор, ни гуминовые кислоты, даже в достаточно жестких условиях, с колонки не элюируются. По-видимому, гуминовые кислоты, обладая выраженным электрическим зарядом, чрезвычайно прочно связываются с анионообменником, удерживая одновременно и ингибитор. Аналогичный эксперимент, в котором вместо анионообменника использовали катионит (СМ сефадекс А 25), также не привел к желаемым результатам. Доказательством того, что носитель ингибиторной активности комплексируется с гуминовыми кислотами, послужил эксперимент, в котором через колонку, заполненную гелем сефадекс 0150 фильтровали изолированные гуминовые кислоты и высокоочищенную фракцию сапропеля, содержащую антикоагулянт (элю—ент 0,075 М аммонийно-ацетатный буферный раствор, колонка 15x320 мм, внешний объем 16 мл, объем фракций 2 мл): хрома 196 тографические профили при гель-фильтрации гуминовых кислот (по данным спектрофотометрии) и фракции сапропеля совпадают между собой. Итак, приведенные выше эксперименты убеждают, что полученная нами фракция сапропеля с антикоагулянтной активностью в своем составе имеет два основных компонента гуминовые кислоты и носитель, обеспечивающий ингибирование плазмокоагуляции. Не вызывает сомнения и тот факт, что гуминовые кислоты и ингибитор образуют между собой достаточно прочный комплекс, не распадающийся при гель-фильтрации фракции на сефадексе О1.60 и гель-хроматографии на ЭЕАЕ сефадексе А 25. Основываясь на данных литературы о достаточно высокой молекулярной массе гуминовых кислот (50-10 ООО кДа) и выраженном общем электростатическом заряде, мы попытались осадить кислоты водоотнимающими агентами спиртом и ацетоном, создавая степень насыщения от 50 до 100%. Однако в этих условиях осаждения гуминовых кислот не происходило. Далее мы прибегли к высаливанию сульфатом аммония. Для этого к концентрированной фракции сапропеля на холоду (ледяная баня) добавляли насыщенный раствор сульфата аммония. При этом наблюдали выпадение осадка гуминовых кислот, наличие которых подтверждается качественной реакцией (при добавлении 1Н серной кислоты и нагревании до кипения выпадает хлопьевидный осадок), проведенной после центрифугирования и растворения осадка в дистиллированной воде. Одновременно, нами получены сведения, что полученные гуминовые кислоты не обладают антикоагулянтной активностью (растворы гуминовых кислот не ограничивают ни время рекальцификации, ни реакцию взаимодействия тромбина с фибриногеном). |