|
Основываясь на данных литературы /Комиссаров И.Д., Логинов Л.Ф., 1971/ о достаточно высокой молекулярной массе гуминовых кислот (50 10 ООО кДа) и выраженном общем электростатическом заряде, мы попытались осадить кислоты водоотнимающими агентами спиртом и ацетоном, создавая степень насыщения от 50 до 100%. Однако в этих условиях осаждения гуминовых кислот не происходило. Далее мы прибегли к высаливанию сульфатом аммония. Для этого к концентрированной фракции сапропеля на холоду (ледяная баня) добавляли насыщенный раствор сульфата аммония. При этом наблюдали выпадение осадка гуминовых кислот, наличие которых подтверждается качественной реакцией (при добавлении 1Н серной кислоты и нагревании до кипения выпадает хлопьевидный осадок), проведенной после центрифугирования и растворения осадка в дистиллированной воде. Одновременно, нами получены сведения, что полученные гуминовые кислоты не обладают антикоагулянтной активностью (растворы гуминовых кислот не изменяют ни время рекальцификации, ни реакцию взаимодействия тромбина с фибриногеном). Эти данные обусловили следующий эксперимент поиск оптимальных условий осаждения гуминовых кислот с помощью высаливания сульфатом аммония. С этой целью в концентрированной фракции сапропеля создавали насыщение сульфата аммония от 30 до 75%. Поскольку высаливание молекул, подобных гуминовым, зависит от их общего электростатического заряда, операцию проводили при различных значениях рН (от 2,6 до 9,4) раствора фракции экстракта. При этом определяли минимальную степень насыщения, при которой появлялся осадок. Наименьшая степень насыщения фракции экстракта (40%), при которой гуминовые кислоты начинают выпадать в осадок, соответствует значению рН 7,25. В связи с этим, получаемый нами концентрат 61 |
196 тографические профили при гель-фильтрации гуминовых кислот (по данным спектрофотометрии) и фракции сапропеля совпадают между собой. Итак, приведенные выше эксперименты убеждают, что полученная нами фракция сапропеля с антикоагулянтной активностью в своем составе имеет два основных компонента гуминовые кислоты и носитель, обеспечивающий ингибирование плазмокоагуляции. Не вызывает сомнения и тот факт, что гуминовые кислоты и ингибитор образуют между собой достаточно прочный комплекс, не распадающийся при гель-фильтрации фракции на сефадексе О1.60 и гель-хроматографии на ЭЕАЕ сефадексе А 25. Основываясь на данных литературы о достаточно высокой молекулярной массе гуминовых кислот (50-10 ООО кДа) и выраженном общем электростатическом заряде, мы попытались осадить кислоты водоотнимающими агентами спиртом и ацетоном, создавая степень насыщения от 50 до 100%. Однако в этих условиях осаждения гуминовых кислот не происходило. Далее мы прибегли к высаливанию сульфатом аммония. Для этого к концентрированной фракции сапропеля на холоду (ледяная баня) добавляли насыщенный раствор сульфата аммония. При этом наблюдали выпадение осадка гуминовых кислот, наличие которых подтверждается качественной реакцией (при добавлении 1Н серной кислоты и нагревании до кипения выпадает хлопьевидный осадок), проведенной после центрифугирования и растворения осадка в дистиллированной воде. Одновременно, нами получены сведения, что полученные гуминовые кислоты не обладают антикоагулянтной активностью (растворы гуминовых кислот не ограничивают ни время рекальцификации, ни реакцию взаимодействия тромбина с фибриногеном). 197 Эти данные обусловили следующий эксперимент поиск оптимальных условий осаждения гуминовых кислот с помощью высаливания сульфатом аммония. С этой целью в концентрированной фракции сапропеля создавали насыщение сульфата аммония от 45 до 75%. Поскольку высаливание молекул, подобных гуминовым, зависит от их общего электростатического заряда, операцию проводили при различных значениях рН раствора фракции экстракта. При этом определяли минимальную степень насыщения, при которой появлялся осадок. Наименьшая степень насыщения фракции экстракта (40%), при которой гуминовые кислоты начинают выпадать в осадок, соответствует значению рН 7,25. В связи с этим, получаемый нами концентрат фракции сапропеля приводили к рН 7,25 (исходное значение рН концентрата 5,31), создавали 50% насыщение сульфатом аммония и образующийся осадок гуминовых кислот отделяли центрифугированием. Получаемый надосадок концентрировали в 2 раза выпариванием на водяной бане, создавая таким образом 100% насыщение сульфата аммония. Выпадающий при этом осадок также удаляли центрифугированием. Получаемый нами раствор с носителем антикоагулянтной активности содержат значительное количество солей, поэтому следующим этапом способа явилась разработка отделения солей от антикоагулянта. Общепринятым и простейшим приемом обессоливания является диализ, однако в нашем случае он оказался не пригодным: как соли, так и значительная часть (до 70%) носителя ингибиторной активности оказались в диализирующей жидкости. Другой известный прием хроматография на колонке с сефадексом хотя и была эффективной, но сопровождалась большой (до 95%) потерей ингибитора. |