|
фракции сапропеля приводили к рН 7,25 (исходное значение рН концентрата 5,31), создавали 50% насыщение сульфатом аммония и образующийся осадок гуминовых кислот отделяли центрифугированием. Получаемый надосадок концентрировали в 2 раза выпариванием на водяной бане, создавая таким образом 100% насыщение сульфата аммония. Выпадающий при этом осадок также удаляли центрифугированием. Получаемый нами раствор с носителем антикоагулянтной активности содержал значительное количество солей, поэтому следующим этапом явилась разработка способа отделения солей от антикоагулянтов. Общепринятым и простейшим приемом обессоливания является диализ, однако в нашем случае он оказался не пригодным: как соли, так и значительная часть (до 70%) носителя ингибиторной активности оказались в диализирующей жидкости. Другой известный прием хроматография на колонке с сефадексом хотя и была эффективной, но сопровождалась большой (до 95%) потерей антикоагулянтной активности. Поскольку носители ингибиторной активности хорошо растворимы в этиловом спирте, а используемая для высаливания соль в спирте не растворима, мы прибегли к способу замены растворителя. Для этого к раствору, содержащему эффекторы и сульфат аммония, прибавляли равное количество 96% этанола, экспонировали при температуре -4°С в течение 30 мин и удаляли выпавший осадок солей центрифугированием. Водно-спиртовую смесь упаривали (до появления кристаллов соли) и повторяли указанную операцию. Полученный раствор выпаривали на водяной бане и сухой остаток растворяли в 96% этаноле. Смесь выдерживали на холоду (-4°С, 30 мин) и выпавшую в осадок оставшуюся соль удаляли. Этанол отгоняли, а сухой остаток, содержа62 |
197 Эти данные обусловили следующий эксперимент поиск оптимальных условий осаждения гуминовых кислот с помощью высаливания сульфатом аммония. С этой целью в концентрированной фракции сапропеля создавали насыщение сульфата аммония от 45 до 75%. Поскольку высаливание молекул, подобных гуминовым, зависит от их общего электростатического заряда, операцию проводили при различных значениях рН раствора фракции экстракта. При этом определяли минимальную степень насыщения, при которой появлялся осадок. Наименьшая степень насыщения фракции экстракта (40%), при которой гуминовые кислоты начинают выпадать в осадок, соответствует значению рН 7,25. В связи с этим, получаемый нами концентрат фракции сапропеля приводили к рН 7,25 (исходное значение рН концентрата 5,31), создавали 50% насыщение сульфатом аммония и образующийся осадок гуминовых кислот отделяли центрифугированием. Получаемый надосадок концентрировали в 2 раза выпариванием на водяной бане, создавая таким образом 100% насыщение сульфата аммония. Выпадающий при этом осадок также удаляли центрифугированием. Получаемый нами раствор с носителем антикоагулянтной активности содержат значительное количество солей, поэтому следующим этапом способа явилась разработка отделения солей от антикоагулянта. Общепринятым и простейшим приемом обессоливания является диализ, однако в нашем случае он оказался не пригодным: как соли, так и значительная часть (до 70%) носителя ингибиторной активности оказались в диализирующей жидкости. Другой известный прием хроматография на колонке с сефадексом хотя и была эффективной, но сопровождалась большой (до 95%) потерей ингибитора. 198 ■ Поскольку носитель ингибиторной активности хорошо растворим в этиловом спирте, а используемая для высаливания соль з спирте не растворима, мы прибегли к способу замены растворителя. Для этого к раствору, содержащему антикоагулянт и сульфат аммония, прибавляли равное количество 96% этанола, экспонировали при температуре -4°С в течение 30 мин и удаляли выпавший осадок солей центрифугированием. Водно-спиртовую смесь упаривали (до появления кристаллов соли) и повторяли вышеуказанную операцию. Полученный раствор выпаривали на водяной бане и сухой остаток растворяли в 96% этаноле. Смесь выдерживали на холоду (-4°С, 30 мин) и выпавшую з осадок оставшуюся соль удаляли. Этанол отгоняли, а сухой остаток, содержащий антикоагулянт, растворяли в 0,14 М растворе хлорида натрия и определяли содержание ингибитора и присутствие сульфатов пробой с бария хлоридом. Содержание ингибитора составило на 56% меньше, чем на предыдущем этапе выделения, но примесь гуминовых кислот отсутствовала полностью. Далее мы подвергли очищенный концентрат фракции экстракта из сапропеля гель-фильтрации на колонке с Сефадексом 0-50 (10x300 мм, элюент 0,07 М раствор натрия хлорида, объем фракций 2 мл, внешний объем колонки 15 мл, скорость протока 1 мл/мин) (рис. 36). Во фракциях элюата определили ингибиторную активность. Как следует из рисунка 36, при гель-фильтрации фракции, освобожденной от гуминовых кислот, носитель антикоагулянтной активности элюируется в виде двух не накладывающихся друг на друга пиков, что свидетельствует о присутствии в полученной фракции минимум двух индивидуальных носителей, различающихся по молекулярной массе. |