|
ления первых мономеров до образования фибринового сгустка. Это заключение мы проверили, исследуя влияние ингибиторов непосредственно на самосборку мономерного фибрина по методу, предложенному В.Л. Белицером /1975/, суть которого заключается в том, что эффектор вносят в реакционную смесь (раствор мономерного фибрина) в разные интервалы времени от момента инициации процесса, т.е. от момента разведения фибринмономера. Таким образо*м, производится изменение условий реакции в разные моменты от начала самосборки, что позволяет различить в ней два этапа до и после внесения ингибитора, и использовать графический способ анализа в системе координат, где абсцисса общая продолжительность первого этапа (до внесения ингибитора), ордината экспериментально установленное время образования фибрина при внесении ингибиторов в разные сроки от начала процесса. Точки, соответствующие времени самосборки при внесении ингибитора в момент инициации процесса (Т2) и в момент его завершения (Т), соединены прямой, характеризующей изменение времени самосборки в случае, когда все этапы равно чувствительны к действию ингибитора. Экспериментально установленное время самосборки при запаздывающем внесении ингибиторов представлено кривой (а), которая отражает неодинаковую чувствительность разных этапов процесса самосборки к действию изучаемого эффектора. Прерывистой линией представлено время самосборки мономерного фибрина в контроле (рис. 22). В эксперименте использован ингибитор в концентрации 71 ЕА/мл. Самосборку провоцировали разбавлением боратным буфером (рН 7,6; 0,075 М). 83 |
70с молекулярной массой 1 470 Да, поскольку (по данным Е.Л. Чирятьева /1990/), он является предшественником двух других и влияние всех трех ингибиторов на самосборку однотипно. Ингибитор и мономерный фибрин получали как описано в разделе “Материалы и методы”. Прежде всего мы изучали в динамике изменения степени взаимодействия ингибитора и субстрата в процессе самосборки, используя для этого метод “тестирования стадий”, предложенный В.А. Белицером и Т.В. Варецкой /1975/: ингибитор 1,8 (ммоль/л) вносили в реакционную смесь, состоящую из мономерного фибрина (активность 35 с) и 0,075 М боратного буфера, через кратные интервалы (5 с) времени от начала самосборки, т.е. от момента разведения фибринмономера. Эти опыты можно рассматривать как тест, в ходе которого производится изменение условий реакции в разные моменты от начала самосборки, что позволяет различить в ней два этапа до и после внесения ингибитора, и использовать графический способ анализа в системе координат (рис. 2), где абсцисса продолжительность первого этапа (до внесения ингибитора), ордината экспериментально установленное время образования фибрина без ингибитора и при внесении ингибитора в разные сроки от начала процесса. Нижний предел первого этапа соответствует эксперименту, в котором ингибитор вносили в самом начале самосборки (время первого этапа равно нулю). Верхний предел соответствует эксперименту, в котором ингибитор вносили в момент появления фибрина (время первого этапа равно единице). Соответственно время второго этапа в первом случае равно единице, во втором нулю. За единицу времени, соответствующую всей длине абсциссы, принята максимальная продолжительность первого этапа (35 с) она соответствует 71абсциссе А. Калибровка абсциссы А составлена из долей единицы, выражающих одновременно долю времени и долю промежуточных превращений первого этапа самосборки. На абсциссе Б, максимальное значение которой равно 1-Л при Л, равном нулю, отложены доли величины 1-А, отражающие доли времени и доли промежуточных превращений второго этапа. Точки, соответствующие времени самосборки при максимальной продолжительности первого (Т^) и второго (Тд) этапов процесса, соединены прямой, которая характеризует изменение времени самосборки в случае, если все ее этапы равно чувствительны к действию ингибитора. Экспериментально установленное время самосборки при запаздывающем внесении ингибитора (т.е. при изменении продолжительности первого и второго этапов) представлено кривой, которая отражает неодинаковую чувствительность /разных этапов процесса самосборки к действию ингибитора. Нисходящая часть кривой отклоняется вниз от теоретической, что свидетельствует о снижении чувствительности процесса к ингибитору с увеличением продолжительности первого этапа самосборки: чем больше его продолжительность, тем больше расстояние между теоретической и экспериментальной линиями. Начиная с точки, соответствующей 0,43 части всей продолжительности первого этапа, участок экспериментальной кривой паралелен оси абсцисс, следовательно, все доли превращений, приходящиеся на последние 0,57 части продолжительности самосборки, одинаково чувствительны к действию ингибитора. Этот уровень чувствительности сохраняется, вероятно, до появления видимых нитей фибрина. Из вышеуказанного эксперимента ясно, что ингибитор активнее взаимодействует с ранними продуктами самосборки, а по мере созревания протофибрилл активность образования ассоциатов 144процесс ингибиторов, выделенных из кривоцвета полевого, окопника лекарственного и медуницы мягчайшей. Следует подчеркнуть, что время влияния этих эффекторов на процесс формирования протофибрилл составляет от 67,5 до 75% от контрольного. Таким образом, на основании вышеприведенных данных можно сделать предварительное заключение, что даже с учетом ограничения скорости взаимодействия тромбина с фибриногеном (ограничения ферментативного этапа этой реакции) наблюдается явная тенденция преимущественного влияния ингибиторов на более ранние стадии формирования протофибрилл, уменьшения этого влияния в процессе роста волокон и полного его отсутствия при прохождении 2/3 пути от момента появления первых мономеров до образования фибринового сгустка. Это важное, на наш взгляд, заключение мы проверили, исследуя влияние ингибиторов непосредственно на самосборку мономерного фибрина по методу, предложенному В.А. Белицером /1975/, суть которого описана в разделе 4.1., стр. 70. Прерывистой линий представлено время самосборки мономерного фибрина в контроле (рис. 29). Прямая 1 характеризует изменение времени самосборки в случае одинаковой чувствительности всех ее этапов к действию ингибиторов. Кривая 2 экспериментально установленное время самосборки. В эксперименте использован мономерный фибрин в концентрации 2x10'6 М и ингибиторы из нонеи темной, медуницы мягчайшей, кривоцвета полевого и окопника лекарственного в концентрациях 0,64х10*3, 0,68х103, 1,1x103 и 1,25х 10*3 мг/мл. Самосборку провоцировали 0,075 М боратным буфером с рН 7,6. Также, как и двух последних экспериментах, характер изучаемых зависимостей был одинаков, поэтому и в данном случае во |