|
пензии. Затем полученную суспензию помещали во флакон и плотно его закрывали. Б качестве консервирующей жидкости использовали консервант Турдыева, который включает 0,2% водный раствор азотистокислого натрия 80 мл, концентрированного формалина 10 мл, концентрированного раствора Люголя 8 мл, глицерина 2мл (Гснис, 1979). 2 .1 .2 .6 . Микроскопия препаратов Выявление бластоцист в препаратах проводили путем микроскопии нативных или окрашенных мазков, либо после формалин эфирного осаждения по Ритчи в модификации Аллена-Ридли. Размеры бластонисг определяли при помощи окуляр-микрометра. Для приготовления нативного препарата на предметное стекло пипеткой наносили каплю физраствора или раствора Люголя, в которых эмульгировали биологический материал. Далее мазок накрывали покровным стеклом. При необходимости с целью предотвращения высыхания препарата покровное стекло окантовывали вазелиновым маслом. Приготовленные препараты микроскопировали (х10 х40). При необходимости проводили дополнительное окрашивание препаратов по методу Романовского-Гимза и железным гематоксилином по Гейденгайну (Генис, 1979). 2 .1 .2 .7 . Определение патогенности бластоцист Патогенные свойства бластошст определяли путем внутрибрюшинного введения белым мышам (массой 23,1+2,2 г) 0,5 мл взвеси культуры простейших, выращенной на среде К.Suresh. Для этого производили серийные разведения взвеси культуры простейших (0,5мл) от 101109 КОЕ/мл. Затем 0,5 мл взвеси бластоцист каждого разведения вводили минимум 6 мышам. Следовательно, для изучения каждого штамма простейших B.hominis использовали 54 животных. Через суши у 53 |
49 2.2.1.Метод консервирования 3 грамма свежих фекалий помещали во флакон с консервирующей жидкостью в соотношении 1:3 и тщательно размешивали до получения гомогенной суспензии. Затем полученную суспензию помещали во флакон и плотно его закрывали. В качестве консервирующей жидкости использовали консервант Турдыева, который включает 0,2% водный раствор азотистокислого натрия 80 мл., концентрированного формалина 10 мл., концентрированного раствора Люголя (4г. йодистого калия, 100мл. дистиллированной воды, 2г. кристаллического йода) 8 мл, глицерина 2мл (Д.Е.Генис, 1979). 2.2.2. Метод обогащения материала Для повышения эффективности обнаружения простейших фекалии, помещенные в консервант, концентрировали методом формалин эфирного осаждения по Ритчи в модификации Аллена Ридли (Т.В.Сахарова, 1997). Для этого пипеткой 2-3 мл. отстоявшейся суспензии переносили в центрифужную пробирку, доливали 10% раствор формалина до 6 -7 мл., затем 2 -3 мл. эфира. Далее пробирку закрывали резиновой пробкой, энергично встряхивали в течение 30 секунд и центрифугировали при 1500 об/мин в течение 2-3 минут. После этого надосадочнуго жидкость и фекальную пробку' удаляли, осадок использовали для микроскопии. 2.2.3. Микроскопия препаратов Выявление бластоциет в препаратах проводили путем микроскопии нативных или окрашенных мазков, либо после формалин эфирного осаждения по Ритчи в модификации Аллена-Ридли. Размеры бластоцист определяли при помощи окуляр микрометра. 50 Для приготовления нативного препарата на предметное стекло пипеткой наносили каплю физраствора или раствора Люголя, в которых эмульгировали биологический материал. Далее мазок накрывали покровным стеклом. При необходимости с целью предотвращения высыхания препарата покровное стекло окантовывали вазелиновым маслом. Приготовленные препараты микроскопировали (х10 х40). При необходимости проводим дополнительное окрашивание препаратов но методу но Романовскому-Гимзе и железным гематоксилином по Гейденгайну (Д.Е.Гепис, 1979). 2.2.4. Определение вирулентности микроорганизмов путём впутрпбрюшннного заражения мышей Вирулентность бластоцист определяли путем внутрибрюшинного введения белым мышам (массой 14,0-16,0г.) 0,5 мл взвеси культуры простейших, выращенной на среде K.Suresh. В начале производили серийное разведение взвеси культуры простейших (0,5мл) or Ш1109 КОЕ/мл. Затем 0,5 мл взвеси бластоцист каждого разведения вводили минимум 6 мышам. Следовательно, для изучения каждого штамма простейших B.hominis использовали 54 животных. Через сутки у каждого штамма определяли величину LD50. В соответствии с получаемыми показателями к высоко вирулентным относили штаммы с LD50 от 101до 103 КОЕ/мл, к умеренно вирулентным от 103 до 106 КОЕ/мл, а штаммы с LD50 свыше 106 КОЕ/мл считали слабовирулентными (Н.И.Костюкова и соавт., 1996). 2.2.5. Метод определения энтеротоксическон активности После предварительного суточного голодания кролики под эфирным наркозом подвергались лапаротомии. Затем в рапу выводили проксимальный участок тонкой кишки, на который накладывали лигатуру на расстоя |