|
17 2. Основная часть 2.1. Иммуноферментный анализ и его применение в ветеринарии В течение последних десятилетий в диагностике инфекционных болезней широкое применение получил твердофазный иммуноферментный анализ. В отличие от классических иммунологических методов лабораторной диагностики, основанных на феноменах преципитации или агглютинации, инфекционный агент выявляется на первой фазе взаимодействия антиген-антитело и при последующей фермент-субстратной реакции, что определяет высокую чувствительность метода. В патентной и научной литературе появляется все больше сведений о рекордных пределах обнаружения веществ данным методом, вплоть до 10-21 молей в образце [37]. Высокие результаты достигаются благодаря использованию неограниченных возможностей ферментов биокатализаторов, которые позволяют создать каскадные системы усиления различных химических сигналов. Ферменты, используемые в иммуноанализе, должны удовлетворять следующим требованиям: доступность в чистом виде; простота и чувствительность методов определения продуктов ферментативной реакции; высокая стабильность и активность конъюгатов при хранении в условиях выполнения анализа. Наибольшее применение в иммуноферментном анализе среди ферментов, удовлетворяющих перечисленным выше требованиям, получили пероксидазы из корней хрена, щелочная фосфатаза из слизистой кишечника теленка и ргалактозидазы Е. coli. Все три фермента определяются на уровне пикомолярных концентраций. Пероксидаза остается самым доступным ферментом. Она содержит легко окисляемые перйодатом углеводные остатки, через которые может осуществляться связывание фермента с антителами или антигенами. В состав субстратной системы для измерения активности пероксидазы фотометрическим |
7 2 Обзор литературы 2.1 Иммуноферментный анализ и его применение в ветеринарной вирусологии В течение последнего десятилетия в диагностике инфекционных заболеваний широкое распространение получили методы иммуноферментного анализа. В отличие от классических иммунохимических методов лабораторной диагностики, основанных на образовании антителами в присутствии антигена преципитата (осадка), в ИФА уникальная специфичность иммунохимического анализа сочетается с высокой чувствительностью детекции ферментативной метки. В патентной и научной литературе появляется все больше сведений о рекордных пределах обнаружения веществ данным методом, вплоть до 10-21 молей в образце (А. Ройт с соавт., 2000). Высокие результаты достигаются благодаря использованию неограниченных возможностей ферментов биокатализаторов, которые позволяют создать каскадные системы усиления различных химических сигналов. Ферменты, используемые в иммуноанализе, должны удовлетворять следующим требованиям: доступность в чистом виде; простота и чувствительность методов определения продуктов ферментативной реакции; высокая стабильность и активность конъюгатов при хранении и в условиях выполнения анализа. Наибольшее распространение в иммуноферментном анализе среди ферментов, удовлетворяющих перечисленным выше требованиям, получили пероксидазы из корней хрена, щелочная фосфатаза из слизистой кишечника теленка и Р-галактозидазы Е. coli. Все три фермента определяются на уровне пикомолярных концентраций. Пероксидаза остается самым доступным ферментом. Она содержит легко окисляемые перйодатом углеводные остатки, через которые может 8 осуществляться связывание фермента с антителами или антигенами. В состав субстратной системы для измерения активности пероксидазы фотометрическим способом входят хромогены, дающие при окислении перекисью окрашенные соединения. Каталитическая активность получаемых конъюгатов остается достаточно высокой, так как при соблюдении мягких условий окисления (Gallacher, 1981) активный центр фермента не затрагивается и остается слабо экранированным. Пероксидаза является гемсодержащей оксидоредуктазой, катализирующей окисление перекисью водорода различных органических соединений. Типичными, быстро окисляющими субстратами пероксидазы являются фенолы, ароматические амины и диалкиламины. Такие часто применяемые субстраты, как о-фенилендиамин, 5-аминосалициловая кислота, бензидин и его гомологи в результате окислительной конденсации образуют интенсивно окрашенные продукты. Растворы субстратов готовят непосредственно перед употреблением; спонтанное окисление субстрата в растворе, в том числе и в присутствии перекиси водорода, может быть замедлено добавлением полиэтиленгликоля или другого водорастворимого полимера (Gallacher, 1986). Стабилизация водных растворов 3,3', 5,5'-тетраметилбензидина достигается добавлением N-метилпирролидона (Parham, Warren, 1986). Удобны в работе водорастворимые алкилсульфонаты тетраметилбензидина (Wada, Kosaka, 1986). Фенолы и 14,М-диалкиламины применяются обычно в составе двухкомпонентных субстратных смесей: вторым компонентом являются соединения с первичными ароматическими аминогруппами. В результате такого окисления образуются красители хинониминового ряда. Типичными аминами являются 4-аминоантипирин, мили пзамещенные анилины (Katsuyama, Shishido, 1983; Trager, Sojka, 1983; Gantzer, 1985), 3-амино9-этилкарбозол (Gallacher, 1986). Отличается особенно быстрое развитие окраски при применении 4-йодфенола (Stout, 1984). Преимущества одних комбинаций реагентов перед другими могут состоять в стабильности при |