|
18 способом входят хромогены, дающие при окислении перекисью окрашенные соединения. Каталитическая активность получаемых конъюгатов остается достаточно высокой, так как при соблюдении мягких условий окисления активный центр фермента не затрагивается и остается слабо экранированным [113]. Пероксидаза является гемсодержащей оксидоредуктазой, катализирующей окисление перекисью водорода различных органических соединений. Типичными, быстро окисляющими субстратами пероксидазы являются фенолы, ароматические амины и диалкиламины. Такие часто применяемые субстраты, как о-фенилендиамин, 5-аминосалициловая кислота, бензидин и его гомологи в результате окислительной конденсации образуют интенсивно окрашенные продукты. Растворы субстратов готовят непосредственно перед употреблением; спонтанное окисление субстрата в растворе, в том числе и в присутствии перекиси водорода, может быть замедлено добавлением полиэтиленгликоля или другого водорастворимого полимера [114]. Стабилизация водных растворов 3,3', 5,5'-тетраметилбензидина достигается добавлением N-метилпирролидона [189]. Удобны в работе водорастворимые алкилсульфонаты тетраметилбензидина [230]. Фенолы и N,N-диалкиламины применяются обычно в составе двухкомпонентных субстратных смесей: вторым компонентом являются соединения с первичными ароматическими аминогруппами. В результате такого окисления образуются красители хинониминового ряда. Типичными аминами являются 4-аминоантипирин, мили пзамещенные анилины [116, 155, 227], 3амино-9-этилкарбозол [114]. Отличается особенно быстрое развитие окраски при применении 4-йодфенола [217]. Преимущества одних комбинаций реагентов перед другими могут состоять в стабильности при хранении растворов или сухих составов, в скорости развития окраски, ее интенсивности и стабильности во времени после остановки реакции. Ы,Ы-диалкиланилины, содержащие в алкильной цепи карбоксильную [227] или фосфатную группу [111], стабильны при хранении, дают интенсивную и стабильную окраску [227] и низкую неспецифическую реакцию в присутствии белков нормальной сыворотки [111]. |
8 осуществляться связывание фермента с антителами или антигенами. В состав субстратной системы для измерения активности пероксидазы фотометрическим способом входят хромогены, дающие при окислении перекисью окрашенные соединения. Каталитическая активность получаемых конъюгатов остается достаточно высокой, так как при соблюдении мягких условий окисления (Gallacher, 1981) активный центр фермента не затрагивается и остается слабо экранированным. Пероксидаза является гемсодержащей оксидоредуктазой, катализирующей окисление перекисью водорода различных органических соединений. Типичными, быстро окисляющими субстратами пероксидазы являются фенолы, ароматические амины и диалкиламины. Такие часто применяемые субстраты, как о-фенилендиамин, 5-аминосалициловая кислота, бензидин и его гомологи в результате окислительной конденсации образуют интенсивно окрашенные продукты. Растворы субстратов готовят непосредственно перед употреблением; спонтанное окисление субстрата в растворе, в том числе и в присутствии перекиси водорода, может быть замедлено добавлением полиэтиленгликоля или другого водорастворимого полимера (Gallacher, 1986). Стабилизация водных растворов 3,3', 5,5'-тетраметилбензидина достигается добавлением N-метилпирролидона (Parham, Warren, 1986). Удобны в работе водорастворимые алкилсульфонаты тетраметилбензидина (Wada, Kosaka, 1986). Фенолы и 14,М-диалкиламины применяются обычно в составе двухкомпонентных субстратных смесей: вторым компонентом являются соединения с первичными ароматическими аминогруппами. В результате такого окисления образуются красители хинониминового ряда. Типичными аминами являются 4-аминоантипирин, мили пзамещенные анилины (Katsuyama, Shishido, 1983; Trager, Sojka, 1983; Gantzer, 1985), 3-амино9-этилкарбозол (Gallacher, 1986). Отличается особенно быстрое развитие окраски при применении 4-йодфенола (Stout, 1984). Преимущества одних комбинаций реагентов перед другими могут состоять в стабильности при 9 хранении растворов или сухих составов, в скорости развития окраски, ее интенсивности и стабильности во времени после остановки реакции. Ы,Ы-диалкиланилины, содержащие в алкильной цепи карбоксильную (Trager, Sojka, 1983) или фосфатную группу (Frey et al., 1986) стабильны при хранении, дают интенсивную и стабильную окраску (Trager, Sojka, 1983) и низкую неспецифическую реакцию в присутствии белков нормальной сыворотки (Frey, Zimmermann, 1986). Для повышения стабильности конъюгатов пероксидазы при лиофилыюй сушке, хранении и стоянии в растворе очень часто авторы используют различные добавки (Shaffar, 1981; Dawson, Homan, 1982; Brodbeck, Gallati, 1984; Anawis, Lindberg, 1985; Sun Ming, 1985; Klenner, Kleinhammer, 1986; Wehner, Mattersberger, 1986). Так, рекомендовано включение в композиции ионов алюминия, магния, цинка (Dawson, Homan, 1982), солей кальция (Dawson, Homan, 1982; Anawis, Lindberg, 1985), полиэтиленгликоля (Anawis, Lindberg, 1985), антибиотиков (Sun Ming, 1985). Щелочная фосфатаза и ее конъюгаты имеют высокую стабильность и низкий предел обнаружения, однако недостатком является относительно высокая стоимость фермента. В последнее время разработаны сверхчувствительные ферментативные системы, позволяющие детектировать в растворе до нескольких тысяч молекул щелочной фосфатазы, основанные на использовании в качестве субстрата молекулы ЫАДР. Образующийся в результате ферментативного гидролиза продукт NAД определяется в ферментативной системе регенерации кофактора (А.М. Егоров с соавт., 1991). Такого рода подходы для определения щелочной фосфатазы являются весьма перспективными в плане создания на их основе сверхчувствительных методов ИФА. р-Д-галактозидаза также широко используется в ИФА. Из других ферментов, предлагавшихся в последние годы для твердофазного иммуноанализа, заслуживают упоминания ацетилхолинэстераза электрического угря (Grassi, Pradelles, 1985), а-амилаза (Ashihara, Kasahara, 1985), пирофосфатаза из E.coli (А.А. Байков с соавт., 1987). Анализ |