|
19 Для повышения стабильности конъюгатов пероксидазы при лиофилизации, хранении в растворе очень часто авторы используют различные добавки [62, 77, 106, 156, 211, 219, 232]. Так, рекомендовано включение в композиции ионов алюминия, магния, цинка [106], солей кальция [62, 106] полиэтиленгликоля [62], антибиотиков [219]. Щелочная фосфатаза и ее конъюгаты имеют высокую стабильность и низкий предел обнаружения, однако недостатком является относительно высокая стоимость фермента. В последнее время разработаны сверхчувствительные ферментативные системы, позволяющие детектировать в растворе до нескольких тысяч молекул щелочной фосфатазы, основанные на использовании в качестве субстрата молекулы NAJIP. Образующийся в результате ферментативного гидролиза продукт определяется в ферментативной системе регенерации кофактора [34]. Такого рода подходы для определения щелочной фосфатазы являются весьма перспекшвными в плане создания на их основе сверхчувствительных методов ИФА. р-Д-галактозидаза также широко используется в ИФА. Из других ферментов, предлагавшихся в последние годы для твердофазного иммуноанализа, заслуживают упоминания ацетилхолинэстераза электрического угря [126] и а-амилаза [65]. Анализ литературных данных показывает, что многие зарубежные фирмы в создании усовершенствованных методов твердофазного иммуноанализа идут по пути поиска новых ферментов. Представляется, однако, маловероятным, что поиск новых ферментов приведет к существенному повышению чувствительности анализа. Более перспективны, вероятно, пути увеличения количества связанного фермента в конъюгате или применения комбинаций ферментов так называемый метод “каскадной амплификации”. Для обогащения конъюгатов ферментом можно использовать для конъюгации предварительно полимеризованный фермент [112], оригинальный способ увеличения количества фермента состоит во включении его в лииосомы [231]. Метод каскадной амплификации, предложенный сотрудниками фирм Du Ропт dc Nemours [129], Miles [76] и другими авторами [136, 146], основан на использовании в качестве метки и |
9 хранении растворов или сухих составов, в скорости развития окраски, ее интенсивности и стабильности во времени после остановки реакции. Ы,Ы-диалкиланилины, содержащие в алкильной цепи карбоксильную (Trager, Sojka, 1983) или фосфатную группу (Frey et al., 1986) стабильны при хранении, дают интенсивную и стабильную окраску (Trager, Sojka, 1983) и низкую неспецифическую реакцию в присутствии белков нормальной сыворотки (Frey, Zimmermann, 1986). Для повышения стабильности конъюгатов пероксидазы при лиофилыюй сушке, хранении и стоянии в растворе очень часто авторы используют различные добавки (Shaffar, 1981; Dawson, Homan, 1982; Brodbeck, Gallati, 1984; Anawis, Lindberg, 1985; Sun Ming, 1985; Klenner, Kleinhammer, 1986; Wehner, Mattersberger, 1986). Так, рекомендовано включение в композиции ионов алюминия, магния, цинка (Dawson, Homan, 1982), солей кальция (Dawson, Homan, 1982; Anawis, Lindberg, 1985), полиэтиленгликоля (Anawis, Lindberg, 1985), антибиотиков (Sun Ming, 1985). Щелочная фосфатаза и ее конъюгаты имеют высокую стабильность и низкий предел обнаружения, однако недостатком является относительно высокая стоимость фермента. В последнее время разработаны сверхчувствительные ферментативные системы, позволяющие детектировать в растворе до нескольких тысяч молекул щелочной фосфатазы, основанные на использовании в качестве субстрата молекулы ЫАДР. Образующийся в результате ферментативного гидролиза продукт NAД определяется в ферментативной системе регенерации кофактора (А.М. Егоров с соавт., 1991). Такого рода подходы для определения щелочной фосфатазы являются весьма перспективными в плане создания на их основе сверхчувствительных методов ИФА. р-Д-галактозидаза также широко используется в ИФА. Из других ферментов, предлагавшихся в последние годы для твердофазного иммуноанализа, заслуживают упоминания ацетилхолинэстераза электрического угря (Grassi, Pradelles, 1985), а-амилаза (Ashihara, Kasahara, 1985), пирофосфатаза из E.coli (А.А. Байков с соавт., 1987). Анализ 10 литературных данных показывает, что многие зарубежные фирмы в создании усовершенствованных методов твердофазного иммуноанализа идут по пути поиска новых ферментов. Представляется, однако, маловероятным, что поиск новых ферментов приведет к существенному повышению чувствительности анализа. Более перспективны, вероятно, пути увеличения количества связанного фермента в конъюгате или применения комбинаций ферментов так называемый метод “каскадной амплификации”. Для обогащения конъюгатов ферментом можно использовать для конъюгации предварительно полимеризованный фермент (Freytag, Ishikawa, 1986), оригинальный способ увеличения количества фермента состоит во включении его в липосомы (Wagner, 1986). Метод каскадной амплификации, предложенный сотрудниками фирм Du Ропт de Nemours (Hall, Hargreaves, 1984), Miles (Blake, Boguslaski, 1985) и другими авторами (Harris, 1984; Johannsson, 1985), основан на использовании в качестве метки и субстрата пары профермент активатор профермента. Например, трипсиноген кишечная энтеропептидаза (энтерокиназа). Другой путь комбинации ферментов, предлагаемый фирмой Syntex, также связан с использованием субстрата, продукт расщепления которого первым ферментом служит субстратом для второго (Brot, Weissbach, 1983; Litman, Ullman, 1985). Всякая процедура химической модификации фермента, даже такого, как пероксидаза, связана с потерей части активности, как при конъюгации, так и при хроматографической очистке конъюгата. Этого можно избежать, если в число реагентов ввести специфическое антитело к ферменту (Noguchi, Nakanishi, 1984; Lenz, Kleinhammer, 1986). Введение небольшого количества конкурентного лиганда в антитело, как правило, существенно не влияет на его иммунологические свойства (Lenz, Kleinhammer, 1986), а комплекс модифицированного антиферментного антитела с ферментом уже является готовым меченым реагентом. Более того, комплекс фермент антифермент (1:1) непосредственно применим в качестве реагента для открытия иммуноглобулинов животных, из сыворотки которого получены |