|
21 Методы химического связывания можно, в свою очередь, разделить на следующие группы: 1 методы периодатного окисления, основанные на образовании новых реакционных групп в ферменте и их последующем взаимодействии с реакционными группами специфического реагента; 2 методы соединения фермента и специфического реагента за счет гомобифункционального реагента; 3 методы соединения фермента и специфического реагента за счет гетеробифункционапьного реагента. Выбор методики приготовления конъюгатов должен исключать возможность полимеризации и определяться стабильностью сшивающего агента в водной среде. Лучшим считается тот метод введения ферментной метки, который позволяет получить значительный выход гибридных молекул при сохранении высокой иммуногенной и энзиматической активности. Показано, что периодатный метод позволяет получить конъюгат, обеспечивающий большую чувствительность в ИФА. Каталитическая активность получаемых конъюгатов остается достаточно высокой, так как при соблюдении мягких условий окисления [113] активный центр фермента не затрагивается и остается слабо экранированным. Полученные конъюгаты наряду с гибридными молекулами содержат остатки непрореагировавших компонентов, применявшихся при конъюгации: бифункциональные агенты, стабилизаторы и т.д. Особенно нежелательно присутствие непрореагировавших молекул антител (антигенов), конкуренция которых с конъюгатом снижает чувствительность анализа. Очистку конъюгата от несвязавшихся компонентов реакции проводят гель-фильтрацией на сефадексе G200 или аффинной хроматографией. Конъюгаты хранят в небольших объемах при 20 -70 °С или в жидком азоте, а также в лиофильно высушенном состоянии при 4 °С. Активность и специфичность иммуноферментных конъюгатов зависит от исходной активности специфических антител. По данным Voller et al. [228], конъюгаты чистых антител с ферментом дают очень низкие значения фона в |
8 осуществляться связывание фермента с антителами или антигенами. В состав субстратной системы для измерения активности пероксидазы фотометрическим способом входят хромогены, дающие при окислении перекисью окрашенные соединения. Каталитическая активность получаемых конъюгатов остается достаточно высокой, так как при соблюдении мягких условий окисления (Gallacher, 1981) активный центр фермента не затрагивается и остается слабо экранированным. Пероксидаза является гемсодержащей оксидоредуктазой, катализирующей окисление перекисью водорода различных органических соединений. Типичными, быстро окисляющими субстратами пероксидазы являются фенолы, ароматические амины и диалкиламины. Такие часто применяемые субстраты, как о-фенилендиамин, 5-аминосалициловая кислота, бензидин и его гомологи в результате окислительной конденсации образуют интенсивно окрашенные продукты. Растворы субстратов готовят непосредственно перед употреблением; спонтанное окисление субстрата в растворе, в том числе и в присутствии перекиси водорода, может быть замедлено добавлением полиэтиленгликоля или другого водорастворимого полимера (Gallacher, 1986). Стабилизация водных растворов 3,3', 5,5'-тетраметилбензидина достигается добавлением N-метилпирролидона (Parham, Warren, 1986). Удобны в работе водорастворимые алкилсульфонаты тетраметилбензидина (Wada, Kosaka, 1986). Фенолы и 14,М-диалкиламины применяются обычно в составе двухкомпонентных субстратных смесей: вторым компонентом являются соединения с первичными ароматическими аминогруппами. В результате такого окисления образуются красители хинониминового ряда. Типичными аминами являются 4-аминоантипирин, мили пзамещенные анилины (Katsuyama, Shishido, 1983; Trager, Sojka, 1983; Gantzer, 1985), 3-амино9-этилкарбозол (Gallacher, 1986). Отличается особенно быстрое развитие окраски при применении 4-йодфенола (Stout, 1984). Преимущества одних комбинаций реагентов перед другими могут состоять в стабильности при |