|
41 удобства определения антител в ELISA, полученные результаты могут быть недостоверными показателями иммунитета. Но до тех пор, пока мы не будем иметь методик определения клеточно-опосредованного иммунитета, которые будут в равной степени просты для исполнения, мы будем доверять традиционным ELISA. В настоящее время доступно, по крайней мере, два различных типа коммерческих ELISA наборов. Первый тип использует планшеты с сорбированным неочищенным или очищенным вирусом. Тестируемую сыворотку вносят на планшет и позволяют реагентам взаимодействовать. Затем добавляют антиглобулин, специфичный для вида птицы и помеченный ферментом, и далее добавляют хромоген. Если в тестируемой сыворотке имеются специфические антитела, энзим-меченый антиглобулин будет фиксирован и его присутствие будет выявлено изменением окраски. Вторым типом является «блокирующий» вариант ELISA, посредством которого тестируемая сыворотка конкурирует с моноклональными антителами, полученными на мышах, за эпитоп вируса, сорбированного на планшете. Поэтому тестируемая сыворотка вносится на планшет, сорбированный вирусом, и ей дают время взаимодействовать. После промывания, таким же образом применяют МаЬ с последующим наслаиванием антимышиного глобулина, помеченного ферментом, а в конце добавляют хромоген. В этом случае, изменение окраски происходит, если тестируемая сыворотка не блокировала МаЬ, (то есть чтение реакции противоположно первому варианту), и является негативной (без специфических антител). Теоретически непрямой метод ИФА является более чувствительным. В то время как блокирующий вариант ELISA показывает более высокую специфичность, поскольку он не зависит от конъюгата к какому-либо из видов птиц. Возможно, поэтому именно этот вариант является более подходящим для тестирования сывороток от различных видов птиц [172]. ELISA антигены могут быть приготовлены на различных системах, включающих ТОК, ФЭК [125J, клетки Vero [11,18,29,87,118,125). |
30 клетки Vero (Giraud et al., 1986; Redmann et ah, 1991; Williams et al., 1991) и клетки MA-104 (Toquin et al., 2000). Eterradossi et al. (1995) обратили внимание на важность выбора антигена для ELISAs. Неудовлетворительный антиген может способствовать получению ложно отрицательного диагноза или кажущейся неиммуногснности вакцины. Необходимо проведение большого объема работы по определению того, какие антитела обнаруживаются различными ELISA и можно ли разработать наборы способные обнаруживать антитела ко всем штаммам, или в качестве альтернативы, к различным подтипам. Необходимо помнить, что, несмотря на все удобства определения антител в ELISA, полученные результаты могут быть недостоверными показателями иммунитета. Но до тех пор, пока мы не будем иметь методик определения клеточно-опосредованного иммунитета, которые будут в равной степени просты для исполнения, мы будем доверять традиционным ELISA. В настоящее время доступно, по крайней мере, два различных типа коммерческих ELISA наборов. Первый тип использует планшеты с сорбированным неочищенным или очищенным вирусом. Тестируемую сыворотку вносят на планшет и позволяют реагентам взаимодействовать. Затем добавляют антиглобулии, специфичный для вида птицы и помеченный ферментом, и далее добавляют хромоген. Если в тестируемой сыворотке имеются специфические антитела, энзим-меченын антиглобулин будет фиксирован и его присутствие будет выявлено изменением окраски. Вторым типом является «блокирующий» вариант ELISA, посредством которого тестируемая сыворотка конкурирует с моноклональными антителами, полученными на мышах, за эпитоп вируса, сорбированного на планшете. Поэтому тестируемая сыворотка вносится на планшет, сорбированный вирусом, и ей дают время взаимодействовать. После промывания, таким же образом применяют МаЬ с последующим наслаиванием антимышиного глобулина, помеченного ферментом, а в конце добавляют хромоген. В этом 31 случае, изменение окраски происходит, если тестируемая сыворотка не блокировала МаЬ, (то есть чтение реакции противоположно первому варианту), и является негативной (без специфических антител). Теоретически, непрямой метод является более чувствительным, в то время как блокирующий вариант EL1SA должен показывать более высокую специфичность, поскольку он не зависит от специфического конъюгата к какому-либо из видов птиц. Возможно, поэтому именно этот вариант является более подходящим для тестирования сывороток от различных видов птиц (McFarlane-Toms & Jackson, 1998). ELISA антигены могут быть приготовлены на различных системах, включающих ТОК (Cook et al., 1988), Эти данные были подтверждены в реакциях нейтрализации (Hafer, 1992). Eterradossi et al.(l 992) обнаружили, что каждый антиген был более эффективен для выявления антител в сыворотках, полученных из той же самой страны, что п антиген, используемый в ELISA, и что эти ELISA наборы реагировали по-разному с одними и теми же полевыми сыворотками. Исследователи говорили о важности использования антигенов, полученных из вирусных штаммов, происходящих из различных географических областей, и предположили, что несоответствующий выбор антигена для ELISA может препятствовать ранней диагностике МПВИ птиц (Eterradossi et ai., 1995). Аналогичную ситуацию установили авторы при определении уровня антител в ELISA у вакцинированной птицы, если в качестве антигена использовали гетерологичный штамм по отношению вакцинному (В.Н.Ирза с соавт., 2003; Toquin et al., 1992; 1996; Eterradossi et al., 1995). |