|
48 Полноту инактивации ВСМ проверяли путем трехкратных пассажей в клетках Vero. Антиген вируса контролировали на специфичность методом полимеразной цепной реакции. Результаты исследований свидетельствовали о специфичности полученного антигена (рисунок 3). Рисунок 3. Наличие фрагмента генома метапневмовируса штамм VC-03 в вируссодержащем материале 1положительный контроль; 2 исследуемая проба. Для получения концентрированного ВСМ был использован метод дифференциального центрифугирования. Вирус из предварительно осветленной культуральной жидкости осаждали при 75000 g в течение 1,0, 1,5 и 2,0 часов. Результаты исследований показали, что метод ультрацетрифугирования позволяет концентрировать ВСМ в 10 раз и полностью без потерь осадить метапневмовирус в течение 1,5 часов. Осадок ресуспендировали в 5,0 см' фосфатно-солевого буфера. ВСМ очищали методом молекулярно-ситовой хроматографии на МПС путем подбора размера диаметра пор стекла, концентрации и pH элюирующего буфера и количества наносимого вирусного материала. Результаты исследований показали, что очистка концентрированного ВСМ, используя МПС с диаметром пор 1000А, 0,01 М ФБР, pH 7,3-7,5 и количество |
45 культуральные матрасы встряхивали и клеточный детрит осаждали центрифугированием при 3000 об/мин в течение 30 мин. Надосадочную вируссодержащую жидкость исследовали на инфекционную активность. Определение инфекционного титра метапневмовируса проводили в пробирочной культуре клеток по ТЦД. Посевная концентрация клеток составила 750 тыс. кл/см3. После формирования монослоя из пробирок удаляли ростовую среду, однократно промывали раствором Хенкса и вносили вирус в разведениях от 10'1 до 10'6, в объеме 0,2 см3, по 4 пробирки на каждое разведение. Результаты оценивали по ЦПД через 3-5 суток после заражения клеток и рассчитывали титр вируса по методу Рида и Менча. Инфекционный титр вируса составил 5,8±0,4 lg ТЦД50/см3. Для получения концентрированного вируссодержащего материала (ВСМ) был использован метод дифференциального центрифугирования. Вирус из предварительно осветленной культуральной жидкости осаждали при 75000 g в течение 1,0, 1,5 и 2,0 часов. Результаты исследований показали, что метод ультрацетрифугировапия позволяет концентрировать ВСМ в 10 раз и полностью без потерь осадить метапневмовирус в течение 1,5 часов. Осадок ресуспендировали в 5,0 см3 фосфатно-солевого буфера. ВСМ очищали методом молекулярно-ситовой хроматографии на МПС путем подбора размера диаметра пор стекла, концентрации и pH элюирующего буфера и количества наносимого вирусного материала. Результаты исследований показали, что очистка концентрированного ВСМ, используя МПС с диаметром пор lOOOAf, 0,01 М ФБР, pH 7,3-7,5 и количество наносимого вирусного материала равное 1/10 части препаративной колонки, приводила к оптимальному разделению вирусного и примесного белка. По внешнему виду очищенный антиген метапневмовируса птиц представлял собой прозрачную опалесцирующую жидкость, без хлопьев и 69 положительной и отрицательной сывороток крови и антивидового иммуноиероксидазного конъюгата, специфичного к IgG кур. Метапневмовирус штамма VC-03 репродуцировали на перевиваемой линии клеток почки африканской зеленой мартышки (клетки Vero) и в культуре клеток СПФ-эмбрионов кур. Максимальное накопление вируса происходило через 120-144 часа после заражения, инфекционный титр вируса составил 5.7 Ig ЦПД5о/1,0 см3, что согласуется с данными И.Л. Борисовой (2008), Б.Б'. Трефилова, JI. 10. Данко (2010), Patnayak et al.(2005). При выборе эффективных методов очистки метапневмовируса мы остановились на традиционном способе очистки вирусов гельфильтрацией на макропористом стекле модифицированном ПВП (В.Д. Сергеев, И.К. Рождественский, 1988), с предварительным осветлением культуральной жидкости центрифугированием при 3000 об/мин в течение 30 минут и концентрированием метапневмовируса методом ультрацентрифугирования при 75000 g в течение 1,5 часов, что позволило сконцентрировать ВСМ в 10 раз и полностью без потерь осадить метапневмовирус. Очистку вируса методом молекулярно-ситовой хроматографии проводили путем подбора размера диаметра пор стекла, концентрации и pH элюирующего буфера, количества наносимого вирусного материала и высоты колонки. Установлено, что при очистке концентрированного ВСМ, используя МПС с диаметром пор 1000А, 0,01 М ФБР, pH 7,3-7,5 и количество наносимого вирусного материала равное 1/10 части препаративной колонки приводило к оптимальному разделению вирусного и примесного белка (рис. 3). По внешнему виду очищенный антиген мегапневмовируса птиц представлял собой прозрачную опалесцирующую жидкость, без хлопьев и осадка. Очистка вируса составила 98,7%, с концентрацией белка 60-80 мг в 1,0 см3. Вторым показателем степени очистки вируса был его выход |