|
49 наносимого вирусного материала равное 1/10 части препаративной колонки, приводила к оптимальному разделению вирусного и примесного белка. По внешнему виду очищенный антиген метапневмовируса птиц представлял собой прозрачную опалесцирующую жидкость, без хлопьев и осадка. Степень очистки вируса составила 98,7%, с концентрацией белка 60-80 мг в 1,0 см3. Вирус разливали по 1,0 см3 во флаконы и хранили при температуре -20° С. В дальнейшей работе его использовали в качестве контрольного антигена при разработке иммуноферментной тест-системы для обнаружения метапневмовируса птиц в биологических материалах. Характерная для метапневмовируса птиц хроматограмма представлена на рисунке 4. Рисунок 4. Хроматограмма очистки метапневмовируса птиц первый пик вирусный белок (I); второй пик примесный белок (2). Колонка: 2 * 80см, объем вируссодержащей жидкости 1,0см3, объем очищенного вируса 12 см3 |
45 культуральные матрасы встряхивали и клеточный детрит осаждали центрифугированием при 3000 об/мин в течение 30 мин. Надосадочную вируссодержащую жидкость исследовали на инфекционную активность. Определение инфекционного титра метапневмовируса проводили в пробирочной культуре клеток по ТЦД. Посевная концентрация клеток составила 750 тыс. кл/см3. После формирования монослоя из пробирок удаляли ростовую среду, однократно промывали раствором Хенкса и вносили вирус в разведениях от 10'1 до 10'6, в объеме 0,2 см3, по 4 пробирки на каждое разведение. Результаты оценивали по ЦПД через 3-5 суток после заражения клеток и рассчитывали титр вируса по методу Рида и Менча. Инфекционный титр вируса составил 5,8±0,4 lg ТЦД50/см3. Для получения концентрированного вируссодержащего материала (ВСМ) был использован метод дифференциального центрифугирования. Вирус из предварительно осветленной культуральной жидкости осаждали при 75000 g в течение 1,0, 1,5 и 2,0 часов. Результаты исследований показали, что метод ультрацетрифугировапия позволяет концентрировать ВСМ в 10 раз и полностью без потерь осадить метапневмовирус в течение 1,5 часов. Осадок ресуспендировали в 5,0 см3 фосфатно-солевого буфера. ВСМ очищали методом молекулярно-ситовой хроматографии на МПС путем подбора размера диаметра пор стекла, концентрации и pH элюирующего буфера и количества наносимого вирусного материала. Результаты исследований показали, что очистка концентрированного ВСМ, используя МПС с диаметром пор lOOOAf, 0,01 М ФБР, pH 7,3-7,5 и количество наносимого вирусного материала равное 1/10 части препаративной колонки, приводила к оптимальному разделению вирусного и примесного белка. По внешнему виду очищенный антиген метапневмовируса птиц представлял собой прозрачную опалесцирующую жидкость, без хлопьев и 46 осадка. Степень очистки вируса оценивали по белку. Очистка вируса составила 98,7%, с концентрацией белка 60-80 мг в 1,0 см3. Вторым показателем степени очистки вируса был его выход по инфекционной активности. Активность мстапневмовируса до очистки соответствовала 5,8±0,4 !g ТЦД 50/см', а после очистки вирус был с активностью 4,8±0,5 lg ТЦД 50/см3. Таким образом, расчеты показали, что выход метапневмовируса по инфекционной активности составил 82,7%. Характерная для метапневмовируса птиц хроматограмма представлена на рис. 3. Рис. 3. Хроматограмма очистки метапневмовируса птиц первый пик вирусный белок (1); второй пик примесный белок (2) Колонка: 2 * 80см, объем вируссодержащей жидкости 1,0см3, объем очищенного вируса 12 см3 2.2.1.2 Получение положительной сыворотки крови кур Для получения специфической гипериммунной сыворотки крови кур к метапневмовирусу птиц использовали клинически здоровых цыплят 20 |